Standart fenol-xloroform usuli yordamida umurtqasiz hayvonlar to’qimasi namunasidan genom dnksini ajratish

1-amaliy mashg’ulot: Standart fenol-xloroform usuli yordamida umurtqasiz hayvonlar to’qimasi namunasidan genom DNKsini ajratish.

Ishning maqsadi: Klassik fenol-xloroform usuli yordamida umurtqasizlar namunasidan genom DNKsini ajratishni o’rganish.
Kerakli asboblar va jihozlar: Mikrotsentrifuga, indikatorli termostat, sterilizator, muzlatgich, suv vannasi, fenol-xloroform reagenti, proteinaza K, zoologik namunalar, turli o’lchamdagi FinnPipete, SealPette pipetkalar va eppendorf probirkalari, qisqich, skalpel.
Ishning nazariy asoslari:
1. Standart fenol - xloroformli usuli va uni asosiy xususiyatlari;
2. Laboratoriya jihozlarini tozalash va ish holatiga keltirish;
3. Ish uchun kerakli eritma va buferlar;
4. DNK va RNK ajratishni ta’minlashda bir qator ustunlik talablar:
– biologik materialni lizisi;
– selektiv ekstraktsiya (sorbtsiya);
– katta hajmda to’plash;
– PTsR susaytiruvchi komponentlardan ajratish;
– DNK va RNK ajratish;
– yuqori foizda chiqishi;
– kalibrovka mumkinligi va ijobiy nazorat;
– kontaminatsiyaning yo’qligi;
– kam vaqt sarflanishi;
– avtomatizatsiyaning mumkinligi.
Qisqacha nazariy qism: Fenol va xloroform usuli (FX) - nuklein kislotalarni ajratishning klassik uslubidir. Bu uslub proteinaza K ishtirokida detergentlar tomonidan biologik materiallarning parchalanishi hamda FX yordamida nuklein kislotalarni ajratib olishni o’z ichiga oladi (1-rasm, a). Buning afzalligi shundaki, kommertsiyali reagentlar to’plamiga qaraganda bu uslub bilan anchagina ko’p miqdorda DNK ajratib olinadi. Uslubning kamchiliklariga esa uning davomiyligi, mashaqqatliligi, agressiv organik erituvchilarning ishlatilishi va DNKni oqsildan ham, RNKdan ham etarli darajada tozalamasligini kiritish mumkin. Laboratoriyada foydalaniladigan jihozlar toza (ayrimlari sterillangan) bo’lishi kerak. Buning uchun avvalo jihozlar suvda yuviladi va distillangan suvda chayiladi. Ish uchun kerakli ayrim instrumentlar (skalpel, qisqich, ignalar) 96% li etanolda yuvilib olinadi. Sterilizatsiya qilinishi mumkin bo’lgan jihozlar sterilizatorda (ko’rsatilgan tartibda) sterilizatsiya qilinadi. Eukariot organizmlardan nuklein kislotalarni ajratish va fraktsiyalashda klassik va kommertsiyali tayyor reagent-to’plam usullaridan foydalaniladi (Kuchboev va boshq., 2015).
Ish uchun kerakli eritma va buferlar tayyorlash bo’yicha tavsiyalar qo’llanmaning 3-ilovasida berilgan.
Laboratoriya ishini bajarish tartibi:
Nematoda to’qimalaridan nuklein kislotalarni FX – ektraktsiya qilish usuli quyidagi bosqichlardan iborat:

1. 
   Nematoda tanasidan 0,05 g og’irlikdagi to’qimani bo’lakchasi olinadi.
   
2. 
   Nematodalarning to’qimalari, tarkibida 40 mM tris – HCl (pH q8,0), 0,5 mM EDTA, 1^xSSC bo’lgan bufer eritmasida (to’qima va buferning 100 mkg; 500 mkg nisbatida) gomogenizatsiya qilinadi.
   
3. 
   0,5% gacha SDS va proteinaza K ni oxirgi kontsentratsiyasi 1 mgG’ml bo’lguncha qo’shiladi, aralashtiriladi va 37°S haroratda 2-3 soat davomida inkubatsiya qilinadi yoki 18 soatga qoldiriladi.
   
4. 
   Probirkaga 5 M natriy atsetat oxirgi kontsentratsiyasi 0,1 M bo’lgunga qadar qo’shiladi va aralashtiriladi. So’ngra 1:1 nisbatda fenol, to’yingan HCl trisi (pHq8,0) qo’shilib, 10-15 daqiqa davomida aralashtiriladi.
   
5. 
   Xloroformni 1:1 nisbatdagi hajmda qo’shib, yana 5-10 daqiqa mobaynida aralashtiriladi.
   
6. 
   Olingan aralashmani 4°S haroratda 20 daqiqa tsentrifuga qilinadi (bir daqiqa davomida 4000 aylanma tezlikda).
   
7. 
   Yuqoridagi fraktsiyani erigan DNK bilan (supernatant) pipetka yordamida tortib olinadi.
   
8. 
   FXli oqsildan ajratish jarayoni (deproteinazatsiya) undan butunlay xolos bo’lgunga qadar takrorlanadi.
   
9. 
   Ajratib olingan supernatantga 2:1 nisbatdagi hajmda xloroform qo’shilib, 10-15 daqiqa aralashtiriladi, so’ngra 15 daqiqa tsentrifuga qilinib (bir daqiqa davomida 4000 aylanma tezlikda) yuqoridagi fazasi olinadi.
   
10. 
    1 ml li erigan DNKga 5 M natriy atsetat oxirgi kontsentratsiyasi 0,2 M bo’lguncha qo’shilib, aralashtiriladi.
    
11. 
    Ikki hajmdagi 96% li etanol eritmasi qo’shilib, DNK cho’kmaga tushgunga qadar bir maromda aralashtiriladi.
    
12. 
    -20°S haroratda bir sutka davomida sovutiladi, so’ngra 15 daqiqa davomida 15000 aylanma tezlikda tsentrifuga qilinadi (0°S gacha sovuguncha).
    
13. 
    Supernatant olib tashlanadi, DNK cho’kmasi 70% li etanol eritmasida yuviladi.
    
14. 
    Etanol eritmasi to’kib tashlanadi, DNK havoda etanol eritmasi uchib ketgunga qadar quritiladi va ionsizlantirilgan suvda eritiladi.
    

Olingan DNK preparatlarini kontsentratsiyasi spektrofotometrda aniqlanadi. Ajratilgan DNK kontsentratsiyasi 2,0 – 2,3 mkgG’mkl tashkil qiladi.

a.

b.

1-rasm. a) DNK esktraktsiyasi uchun fenol-xloroform reagenti; b) Diatom DNA Prep 200 to’plami.