10-ma’ruza: Hujayra muhandisligi Reja

V-bosqich (1940 – 1960 yillar). 1955 yilda yangi sinfga mansub fitogormon – sitokininlarni ixtiro qilinishi, (xususan kinetinni) hujayralarni bo‘linishini kuchaytirish imkonini yaratadi. O‘sishni kuchaytiruvchi moddalarni miqdori va ularni nisbatiga qarab, eksplant hujayrasini bo‘linishini kuchaytirish, kallus to‘qimalarni o‘sishini muhofaza qilish, morfogenezni indutsirovat qilish mumkin ekanligi namoyish etildi.Shu davrda kakos yong‘og‘ini, kashtan, makkajo‘xori va boshqa o‘simliklar endospermalarini hujayrani o‘sishi, morgenez jarayonlari (kallus to‘qima va hujayra suspenziyasida)ga ijobiy ta’sir ko‘rsatishi aniqlashgan.

VI-bosqich (1960 – 1975 yillar). Bu davrni eng muhim voqeasi Nottingen universiteti professori E.K.Kokking tomonidan fermentativ yo‘l bilan pomidorini ildizi va mevasidan protoplastlar olinishi va ularni nazorat qilinib turilgan sharoitda o‘stirilganligi bo‘lgan. Keyinroq shu laboratoriyada Pauer o‘zini shogirdlari bilan protoplastlarni sun’iy qo‘shilish sharoitlarini yaratishgan. Bu esa, somotik gibridlar yaratishda yangi yo‘l bo‘lib xizmat qilgan. O‘sha davrda yaratilgan yana bir usul – bu o‘simliklarni in vitro sharoitida meristema kulturalar ishlatib mikro ko‘paytirishdir. Dastlab bu usul fransuz olimi J.Morel tomonidan orxidey o‘simligini sog‘lom ko‘chatini olish maqsadida yaratilgan.

VII-bosqich – (1975 yildan hozirgi vaqtgacha). In vitro texnikasini jadallik bilan rivojlanishi o‘stiriladigan manbalarni biologiyasini o‘rganish davom etmoqda ajratilgan protoplastlarni elektro qovushtirish usullari ishlab chiqilmoqda, mutagenez va hujayra seleksiyasi usullari, gaploidli o‘simliklar yaratish usullari, hujayralarni ajratilgan protoplastlar va Ti va Ri Agrobacterium tumefaciens va Agrobacterium rhizogenes asosida tayyorlangan Ti va Ri plazmid vektorlarni ishlatib suyuqlikda o‘stirish usullari mukammallashtirilmoqda. Gen muxandisligi usullari yordamida ikki pallali o‘simliklarni genlarini ko‘chirib o‘tkazishni samarali usullari ishlab chiqildi.

Shunday qilib, oxirgi yillarda ajratib olingan o‘simlik hujayralari va to‘qimalari bilan ishlash texnikasi takomilashtirildi. Ammo, bu ishlarda asosiy manba bo‘lib, bir pallali va ikki pallali o‘tlik o‘simliklar xizmat qilgan. Daraxtlarni o‘rganish bo‘yicha olib borilgan ishlar unchalik ko‘p emas.
Ajratib olingan to‘qimalar bilan ishlashni asosiy sharti – sterillikga qat’iy rioya qilishdir. Tarkibi boy bo‘lgan oziqa muhiti mikroorganizmlarni rivojlanishi uchun ham juda yaxshi substrat hisoblanadi, o‘simliklardan ajratib olingan fragmentlar (eksplantlar) oziqa muhiti bilan aralashtirilganda mikroorganizmlar ta’siriga tez uchraydilar.
Shuning uchun ham ekslantni ham, oziqa muhitini ham sterilizatsiya qilish kerak. Ajratilgan hujayralar va to‘qimalar bilan qilinadigan barcha nozik ishlar (manipulyasiya) aseptik sharoitda (laminar-bokslarda) sterillangan uskunalar yordamida bajariladi. Ajratilgan to‘qimalarni o‘stirish davrida ham sterillikni saqlash kerak, ayniqsa xarorat va namlik o‘zgarganda, chunki probirkalarni paxta-bintdan tayyorlangan tiqinchalari namlanadi va undan mikroorganizmlar oson o‘tishadi.
Eksplantni sterilizatsiyasi, shuningdek urug‘lar ham 5-20 minut davomida sterilizatsiya qiluvchi eritmada ushlab turish, keyin esa steril suv bilan yuvib tashlash orqali amalga oshiriladi. Sterilizatsiya davri eksplantni harakteriga hamda eritmani sterilizatsiya qilish xususiyatiga bog‘liq. Odatda urug‘ 10-20 min, vegetativ qismlar esa 5-10 min. davomida sterilizatsiya qilinadi. Eksplant olinmoqchi bo‘lgan o‘simlik organi, dastlab sovunli suv bilan shetkalar yordamida yaxshilab yuviladi va distillangan suv bilan chayib tashlanadi, keyin esa bir necha sekund davomida 70 % li etanolga botirib olinadi. Urug‘lar spirtda 1-2 min. ushlab turiladi. To‘qimalarga spirt bilan ishlov berish, uni sterilizatsiya qilish xossasidan tashqari, asosiy sterilizatsiya qiluvchi eritmani ta’sirini kuchaytirishi bilan ham bog‘liq.
Sterilizatsiya keyin o‘simlik ob’ektlari sterillangan suv bilan tozalab yuvib tashlanishi kerak. Sirtqi sterilizatsiya eksplantni faqat tashqi infeksiyadan ozod qiladi. Agar eksplant to‘qimalari ichki infeksiyaga ega bo‘lsalar, ularga antibiotiklar bilan ishlov berishga to‘g‘ri keladi. Ayniqsa ichki infeksiyaga yirik tomirli tropik va substropik o‘simliklar boy bo‘lishadi. Kulturalarni zamburug‘lar yoki bakteriyalar bilan ifloslanishi ekilgandan 1-14 kun o‘tganda ko‘zga tashlanadi. Yorug‘lik xonasidagi havoni ifloslanishdan saqlash uchun, ifloslangan kulturani darhol yo‘qotish kerak.
Oziqa mhitlarini avtoklvda, 120⁰C da 0.75 – 1,0 atm. bosimda 20 minut davomida sterilizatsiya qilinadi. Agar oziqa muhiti tarkibiga yuqori xaroratda parchalanadigan moddalar kirsa, ularni alohida sovuq sterilizatsiya qilindi. Ularni teshiklar diametri 0,22 – 0,45 mkm, bo‘lgan bakterial filtrlardan o‘tkaziladi va avtoklavdan chiqqan oziqa muhitini 40⁰ C gacha sovutib, keyin ularni aralashtiriladi. Oldindan folgacha yoki o‘raydigan qog‘ozga o‘ralgan idishlarni quruq issiq bilan, quritgich shkaflarida 160⁰C da ikki soat davomida sterilizatsiya qilinadi.