ISHNING BORISHI: - Solod ekstrakti tayyorlash. 20 g maydalangan solod oz miqdordagi suv bilan hovonchada maydalanadi va miqdori bo'yicha 100 ml hajmdagi kolbaga o'tkaziladi, hajmi suv bilan belgiga keltiriladi, tarkibi aralashtiriladi va 2 soat davomida (siz bir kechada sovutishingiz mumkin) muzda qoldiriladi. Ekstraksiya vaqti o'tganidan so'ng, tarkib aralashtiriladi va 3000 ayl/min tezlikda 10 daqiqa davomida sentrifuga qilinadi. Santrifugat amilaza manbai sifatida ishlatiladi.
- α—amilazani ajratish. Sinov probirkasiga faol α-- va β-amilazalarni o'z ichiga olgan 5 ml solod ekstrakti qo'shiladi, pichoq uchiga kaltsiy asetat kukuni qo'shiladi va probirkada 15 daqiqa ushlab turiladi. 68ºC ga qadar isitiladigan suv hammomida (isitish davrida suv harorati 70ºC dan oshmasligi va 66ºC dan pastga tushmasligi kerak). Keyin probirkalar tarkibi sovuq suv bilan sovutiladi. Bunday isitish bilan β-amilaza to'liq inaktivlanadi va α-amilaza o'z faolligini saqlab qoladi. Olingan eritma α-amilaza faolligini aniqlash uchun ishlatiladi.
β –amilaza ajratish. 1.Sig'imi 50 ml bo'lgan kolbaga 5 ml faol a- va b-amilazalarni o'z ichiga olgan solod ekstrakti qo'shing, 2. 4 ml suv, 0,1 mol / l ga teng 1 ml konsentrlangan xlorid kislota eritma qo'shing ( olingan aralashmaning pH qiymati 3,3 bo'lishi kerak). 3. Keyin kolba 15 daqiqa davomida qor yoki muz ustiga qo'yiladi (muzxonaga han qo’yish mumkin). Bunday sharoitda α- -amilaza to'liq inaktivlanadi va β -amilaza o'z faolligini saqlab qoladi. 4.Sovuqda 15 minut turganidan so'ng, kolbga pH qiymatini 6,0 ga etkazish uchun 0,15 mol / l gidrofosfat natriy (Na2HPO4) konsentratsiyali 2 ml eritma qo'shiladi. Olingan eritma β -amilaza faolligini aniqlash uchun ishlatiladi. Solod amilazasi faolligini aniqlash (gidrolizlangan kraxmal massasi bo’yicha) - Ishning borishi. Tajriba uchun 6 ta probirkani olinadi, ulardan bittasi nazorat uchundur. Probirkalar 1-jadvalga muvofiq to'ldiriladi.
- Tajriba probirkalaridagi tarkib aralashtiriladi va 30 daqiqa davomida 37-38 ºC haroratda termostatga joylashtiriladi. Tajribani bunday tartibga solish bir vaqtning o'zida solod ekstraktidagi amilazalarning umumiy faolligini (α-- va β-amilazalar birgalikda), α--amilaza faolligini va β-amilaza faolligini aniqlashga imkon beradi. Inkubatsiya muddati tugagach, probirkalar termostatdan olinadi va darhol har biriga 1 mol / l xlorid kislota konsentratsiyali 2 ml eritma va yodning suvli eritmasidan 3 tomchi qo'shiladi; tarkibi aralashtiriladi.
Do'stlaringiz bilan baham: |
