Biologiya fakulteti Biologiya (turlari bo‘yicha) ta’lim yo‘nalishi

Mirzo Ulug‘bek nomidagi O‘zbekiston Milliy Universiteti

Biologiya fakulteti Biologiya (turlari bo‘yicha) ta’lim yo‘nalishi
3-kurs 302-guruh talabasi
Hosilbekov Jasurbekning
Enzimologiya fanidan tayyorlagan
MUSTAQIL ISHI
Mavzu: Sun'iy metall fermentlari

Toshkent-2022

Sun'iy metall fermentlarini (ARM) yaratish zamonaviy enzimologiyaning ilg'or tadqiqot yo'nalishiga aylandi. ARMlar organokataliz, o'tish metall katalizi va biokataliz o'rtasida bog'lovchi bo'lib xizmat qiladi va sintetik biologiyani preparativ kimyo bilan sinergiya qilish uchun katta imkoniyatlarga ega (Rosati va Roelfes, 2010). Tabiiy fermentlarning taxminan yarmi metalloenzimlar ekanligi uzoq vaqtdan beri ma'lum bo'lgan (Lu va boshq. 2009; Finkelstein 2009). Metallofermentlar termodinamik qattiq reaksiyalar uchun katalizator sifatida, masalan, azotning ammiakga nitrogenaza bilan qaytarilishi, fotosintez jarayonida suvning oksidlanishi va molekulyar kislorodning bir vaqtning o'zida ajralib chiqishi bilan uglevodorodlarga aylanishi kabi keng qamrovli o'rganilgan. Xususiyatlari shaklda keltirilgan AWS. 1 sanoatda, jumladan, bioyoqilg'i, elektr energiyasi, dori-darmonlar va boshqa qo'shimcha qiymatli mahsulotlar ishlab chiqarishda keng qo'llaniladi (Lu et al. 2009; Happe and Hemschemeier 2014).
APM ixtirosi 1970-yillarning oxirida biotin bilan bog'langan avidin oqsiliga biotinlangan rodiy kofaktorini qo'shgan Uilson va Uaytsidlar tomonidan sodir bo'lgan. Bu gidrogenatsiya reaktsiyasini enantioselektiv qiladi va shu bilan birga, rasemik mahsulot ikkinchi koordinatsion sfera / oqsil magistralining yo'qligida hosil bo'lishi ham aniqlandi (Wilson va Whitesides 1978). Biroq, oqsillarni loyihalash / muhandislik va organometalik sintez uchun vositalarning cheklanganligi sababli bu sohadagi taraqqiyot sekinlashdi. So'nggi bir necha o'n yilliklarda tizimli, biofizikaviy va hisoblash biologiyasi sohalarida sezilarli yutuqlar APMga qiziqishni jonlantirdi (Schwizer va boshq. 2018). Bu davrda dala
Ish stantsiyasining dizayni asta-sekin sof konstruktiv dizayndan ko'proq funktsional dizaynga (Yu va boshq. 2014) va sfera modifikatsiyasidan ko'proq ikkinchi muvofiqlashtiruvchi sfera dizayniga va undan tashqariga o'tdi.
Birinchi muvofiqlashtirish sferasi markaziy metall kofaktori va atrofdagi molekulalar o'rtasidagi o'zaro ta'sirlarni nazarda tutsa, ikkinchi muvofiqlashtirish sferasi birinchi muvofiqlashtirish sferasi bilan turli yo'llar bilan bog'langan molekulalar va ionlarga ishora qiladi (Bos and Roelfes 2014).
Ikkinchi muvofiqlashtirish sohasini ta'minlaydigan biosferalarni tanlash uchun quyidagi parametrlar muhimdir:
• Bioskaffold keng pH va harorat oralig'ida barqaror bo'lishi kerak.
• Bioskaffold turli xil organik erituvchilarga xos qarshilik potentsialiga ega bo'lishi kerak, chunki reaktivlar ko'pincha ma'lum miqdorda organik erituvchini talab qiladi.
kataliz.
• Biomolekulyar iskala metall ionlari bilan bog‘lanish joyi o‘tish metalli kofaktorini sig‘dira oladigan darajada katta bo‘lishi kerak, shu bilan birga ular uchun bo‘sh joy bo‘lishi kerak.
reaksiyada ishtirok etish uchun reagentlar. Muvaffaqiyatli yaratilgan funktsional bioskaflarning bir nechta misollari streptavidin (SAB), apomioglobin, BSA va boshqalarni o'z ichiga oladi.
• Aminokislotalar yoki nukleotidlar bo'ladimi, biomolekulyar iskala qurilish bloklari ehtiyotkorlik bilan tanlanishi kerak. Ko'pincha asoratlar paydo bo'lishi qayd etilgan.
DNK magistralidan tashkil topgan ArM dan foydalanganda. Bunday asoratlarning sababi shundaki, DNK umurtqa pog'onasi oksidlanish zanjirining uzilishiga moyil bo'ladi.
• Iskala oldindan mavjud bo'lgan metall kofaktorni bog'lash joyidan iboratmi yoki o'zgartirishlar/modifikatsiyalarni talab qilishiga qarab ehtiyotkorlik bilan tanlanishi kerak. Injiniring yoki yangi ishlab chiqilgan faol saytni bioskaffoldga kiritish kerakmi (Rosati va Roelfes 2010; Bos and Roelfes 2014).
1.1 Ikkinchi koordinatsion sohaning katalizdagi ahamiyati
1. Reaksiya tezligi Reaksiya tezligi ham metall ioni (kofaktor) ham, bioskaffold faolligining natijasidir. Bioscaffolds ijobiy va salbiy reaktsiya tezligiga qanday ta'sir qilishini baholash uchun o'rganilgan. ArM bilan reaksiya tezligining ijobiy o'sishi (ikki martadan ikki darajagacha) ularni o'tish metall katalizatorlaridan afzal qiladi. Natijada kamroq xarajat va vaqt sarflaydigan samarali tizim. Biroq, ba'zi hollarda, salbiy tartibga solish ham sodir bo'lishi mumkin. Supramolekulyar ankraj strategiyalaridan foydalangan holda ishlab chiqilgan APM holatlarida, past konsentratsiyalarda, bog'lanmagan va bog'langan katalizator o'rtasidagi muvozanat joyi dushman bo'lib qolishi, natijada juda ko'p miqdorda bog'lanmagan zarrachalar mavjudligi sababli rasemik mahsulot hosil bo'lishi kuzatilgan. katalizator, bu esa keyinchalik enantiomerik ortiqcha (uning) kamayishiga olib keladi. DNK biosferalariga asoslangan assimetrik katalitik tizimlar bu hodisadan istisno va buning sababi shundaki, DNK iskala bilan bog'langan metall kofaktor kompleksi bog'lanmagan katalizatorga nisbatan sezilarli darajada tezroq (Rosati and Roelfes 2010).
2. Enantioselektivlik. Bioscaffold tomonidan taqdim etilgan chirallik substratning kirib borishini ta'minlaydi va natijada olingan mahsulotlarning enantiomerik xususiyatlarini yanada aniqlaydi.
3. Kimyoselektivlik Bioskaffold atrofdagi mikromuhitning qutbliligini tartibga solishi isbotlangan. Bu bioscaffold reaktsiyaning kimyoselektivligini aniqlashda rol o'ynashini tasdiqlaydi (Rosati va Roelfes 2010).
4. Shakl va o'lcham selektivligi Bugungi kunga qadar ishlab chiqilgan turli xil APMlar turli xil substratlarga ega bo'lgan katalizator tizimini ta'minlashi ko'rsatilgan. Bu noyob xususiyatni kimyokatalizning ajralmas qismi deb hisoblash mumkin. Biroq, ba'zi hollarda, ikkinchi koordinatsion sfera katalizlanadigan reaktsiya uchun substratlarga yoki reaktiv va substrat birikmasiga chegaralar qo'yishi kuzatilgan. Shuningdek, faol sayt va substrat o'rtasidagi aniq muvofiqlikning yo'qligi enantiomerik selektivlik bilan birga funksionallikning to'liq yo'qolishiga olib kelishi kuzatilgan (Rosati va Roelfes 2010).
2 Qurol dizayni
Shaklda. 2-rasmda ArM tuzilishi ko'rsatilgan (Rosati va Roelfes, 2010). ArM ning qurilishi har doim bir yoki bir nechta o'tish metall ionlarini odatda 50 dan ortiq aminokislotalar qoldiqlaridan iborat bo'lgan apoproteinga kiritishni o'z ichiga oladi (Jeschek va boshq. 2018). Qurollarni loyihalashda quyidagi uchta asosiy shartni hisobga olish kerak (Bos va Roelfes, 2014):
1. Kerakli reaksiyani katalizlashga qodir bo'lgan o'tish metall kofaktorini tanlash.
2. O'tish metall ionini bioskaffold bilan bog'lash uchun ankraj strategiyasini tanlash.
3. Bioscaffold tanlovi (ikkinchi muvofiqlashtirish sohasi): oqsil, peptid yoki nukleotid iskala.
Metall kofaktorni tanlashda shuni hisobga olish kerakki, metall kofaktorning reaktivligi ikkinchi koordinatsiya sferasiga ortogonal bo'lishini talab qiladi, ya'ni biomolekulyar iskala tomonidan ta'minlangan kimyoviy reaktivlikka nisbatan inert bo'lishi kerak. Bundan tashqari, suvli muhitda APM faolligini ta'minlash uchun metall ion katalizatorining tabiati suvga chidamli bo'lishi kerak.
ArM ning asosiy afzalliklaridan biri shundaki, ular suvli eritmalarda (Pàmies va boshq. 2015) va noorganik erituvchilarda assimetrik reaktsiyalarni katalizlash imkoniyatiga ega. Bundan tashqari, katalitik reaktsiyalarda APM dan foydalanish bilan bog'liq boshqa afzalliklar mavjud; ularning ba'zilari o'z ichiga oladi: yuqori samaradorlik, yuqori enantioselektivlik, yuqori barqarorlik, yuqori aylanma soni va ferment yangi funksionalligini beradi (Jeschek et al. 2018). Sun'iy metallofermentning yangi funksiyasini amalga oshirish uchun quyidagi dizayn yondashuvlaridan birini hisobga olish mumkin:
1. Sintetik kofaktor yondashuvlari
2. Fermentlarni loyihalash/qayta loyihalash
3. Promiscuity va yo'naltirilgan evolyutsiya asosida tabiiy fermentlarni qayta ishlash.
3 ta majburiy strategiya
Bioskaffoldda metallkofaktorning aniq lokalizatsiyasini ta'minlash uchun maxsus ankraj strategiyalari ishlab chiqilgan (3-rasm) (Rosati va Roelfes 2010), ular quyidagilarni o'z ichiga oladi:
1. Kovalent ankraj Ma'lum biokonjugatsiya usullarini eslatuvchi (Hermanson va Oldin: Hermanson 1997; Stephanopoulos and Frensis 2011), kovalent ankraj kofaktor funktsional guruhi va bioscaffold am komponentlari bo'lishi mumkin bo'lgan yuqori samarali qaytarilmas reaktsiyani o'z ichiga oladi. DNK magistralida oqsillar/peptidlar yoki nukleotidlar holatida kislotalar (Schwizer va boshq. 2018). Bu jarayon bioscaffoldning post-biosintetik modifikatsiyadan o'tishini talab qiladi va qo'shimcha ravishda, ArM qurilishida yuqori selektiv modifikatsiyalarga erishish uchun kofaktorning reaktiv guruhi bioskaffoldga ortogonal bo'lishini talab qiladi (Bos and Roelfes 2014). Ushbu strategiyaning asosiy kamchiliklari jarayonning o'rtasida majburiy tozalash bosqichiga bo'lgan ehtiyojdir (Rosati va Roelfes, 2010). Kovalent ankraj strategiyasidan foydalanish orqali APMni ishlab chiqish bir nechta asosiy reaktsiyalarni o'z ichiga oladi, jumladan:
(a) Oltingugurt elektrofil bilan almashtirilgan metall kofaktor va protein-peptid bioframeworkning sistein qoldig'i o'rtasida disulfid bog'lanishining shakllanishi (Schwizer va boshq. 2018).
(b) metallning elektrofil guruhini (masalan, alfa-galokarbonil, maleimid va boshqalar) nishonga olgan sistein yoki ikkinchi koordinatsion sferada mavjud bo'lgan (bioskaffold tomonidan taqdim etilgan) boshqa faollashtirilgan qoldiq tomonidan amalga oshiriladigan nukleofil almashtirish reaktsiyasi. kofaktor (Schwizer va boshq. 2018). ).
(c) Terminal azid yoki alkin guruhidan tashkil topgan tabiiy bo'lmagan aminokislota yoki alkin yoki azid guruhi bilan almashtirilgan metall kofaktor o'rtasida yuzaga keladigan Huisgen [3+2] siklo yuklanish reaktsiyasi (Yang va boshq. 2014; Schwizer et al. bosh. 2018).
2. Supramolekulyar ankraj Ushbu ankraj usuli sun'iy metall fermentlarining "o'z-o'zini yig'ish" xususiyatidan foydalanadi, bu esa dizayn jarayonida yuqori tezlik va samaradorlikni optimallashtirishga yordam beradi (Rosati va Roelfes 2010). U ma'lum ligandlar to'plamiga yuqori yaqinlik ko'rsatish uchun ma'lum oqsillarning xususiyatidan foydalanadi (Schwizer va boshq. 2018). Masalan, biotin/streptavidin texnologiyasi bilan ishlab chiqilgan APMlar supramolekulyar ankraj strategiyasiga asoslangan. Biotin avidin deb ataladigan oqsilga juda kuchli yaqinlikka ega va biotin bilan bog'langan molekula ichkariga qarab harakatlanadi va ma'lum bir joyga joylashishga moyil bo'ladi. Protein iskalasining bir qismi (masalan, miyoglobin) supramolekulyar ankraj strategiyasiga asoslanadi. Keyinchalik yuqori samaradorlik bilan assimetrik reaktsiyalarni katalizlash uchun mo'ljallangan DNK bioscaffoldsga asoslangan qurollar ushbu strategiyaning yana bir misolidir. Ushbu ankraj strategiyasi bilan bog'liq asosiy muammolardan biri bu heterojen tizimni ishlab chiqishdir, bunda turli mikro muhitda mavjud bo'lgan har bir katalitik maydon aniq o'ziga xos faollik va selektivlikni namoyish etadi. Yana bir muhim jihat shundaki, katalizatorning bog'lanishi supramolekulyar ankrajning selektivligi va kuchiga bog'liq bo'lganligi sababli, katalizatorning qaerga bog'lanishini oldindan aytish juda qiyin. Shuning uchun, bu faol saytning tuzilishi nisbatan kamroq aniqlanishiga olib keladi. Shuning uchun, ikkinchi muvofiqlashtirish sferasi/bioframkadan tashqarida kataliz paydo bo'lishining oldini olish uchun metall kofaktorning biomolekulyar iskala bilan kuchli bog'lanishini ta'minlash muhim (Rosati va Roelfes 2010; Bos and Roelfes 2014).
3. Dative anchoring Ushbu ankraj strategiyasi oqsil/peptid bioskaffoldining nukleofil qoldig'i (masalan, Cys, His, Asp, Glu, Ser va boshqalar) va katalitik faol, muvofiqlashtiruvchi to'yinmagan metall o'rtasida muvofiqlashtirilgan bog'lanishni shakllantirishga asoslangan. kofaktor (Schwizer va boshq. 2018). Ushbu yondashuv bilan bog'liq bo'lgan asosiy afzalliklardan biri shundaki, muvofiqlashtiruvchi aloqa metall kofaktorni biomolekulyar iskala ichida aniq joylashtirish imkonini beradi (Rosati va Roelfes 2010). Ushbu bog'lash strategiyasi ko'pchilik tabiiy metallofermentlarda ishlashi aniqlangan bo'lsa-da, shunga qaramay, ushbu bog'lash strategiyasidan foydalangan holda mahalliy kofaktorni sintetik kofaktor bilan almashtirish orqali ArM qurish juda qiyin, chunki farqlovchi xususiyat metallokofaktor noyob aniq muvofiqlashtiruvchi mikromuhit sharoitlarini talab qiladi (Bos and Roelfes 2014).
4 De novo Metallofermentlarni loyihalash: pastdan yuqoriga yondashuv
Pastdan yuqoriga yondashuv deb ham ataladigan metallofermentlarni yangi loyihalash (4-rasm) asosan tabiatda mavjud bo'lgan oqsillarning birortasiga o'xshamaydigan va o'ziga xos xususiyatlarga ega bo'lgan noyob polipeptid zanjirini qurish bilan bog'liq. metall ioniga (kofaktor) aniq bog'lanish qobiliyatini o'z ichiga olgan aniq belgilangan uch o'lchovli tuzilishga aniq katlanish qobiliyati. So'nggi yillarda ushbu loyihalash usuli hozirgacha tadqiqotchilar e'tiborini jalb qila olmagan metallofermentlarning strukturaviy xususiyatlarini ochishda juda foydali ekanligi ko'rsatildi. Ushbu loyihalash strategiyasi metalloenzimning strukturaviy va funktsional atributlarini to'liq nazorat qilishni ta'minlaydi. Hozirgi vaqtda ushbu strategiya yangi sun'iy metallofermentlarni yaratish uchun ham, tabiiy metallofermentlarni strukturaviy yoki funktsional xususiyatlariga ko'ra taqlid qilish qobiliyatiga ega bo'lgan ArMlarni yaratish uchun ham keng qo'llanilmoqda (Lu va boshq. 2009).
Bugungi kunga kelib, ArMlarni de novo loyihalash bilan bog'liq tadqiqotlarning asosiy yo'nalishi sun'iy ravishda qurilgan alfa spiral polipeptid tuzilmalariga metall kofaktorlarni bog'lash joylarini kiritishga qaratilgan (bu de novo loyihalash yondashuvidan foydalangan holda dastlab ishlab chiqilgan protein tuzilmalaridan biri edi). ). Alfa spiral to'plamlari oqsillarni o'z ichiga olgan turli xil tabiiy gem guruhlarida topilgan eng tez-tez uchraydigan iskala hisoblanadi (DeGrado va boshq. 1999; Reedy va Gibney 2004; Lu va boshq. 2009; Rosati va Roelfes 2010). Bundan tashqari, samarali biomimetik katalitik tizimlarni ishlab chiqarish uchun gem kofaktori, boshqa turli xil metall kofaktorlar ham ishlab chiqilgan va alfa-spiral iskalalarga kiritilgan. Alfa-spiral iskala bilan solishtirganda, beta qatlamli iskalalarni o'z ichiga olgan metallofermentlar ancha qattiqroq va oldindan tashkil etilgan metall ionlarini bog'lash joylarini qo'llab-quvvatlaganligi ma'lum bo'lgan, ammo beta qatlam tuzilmalari tufayli tabiatda alfa spiralli iskalalarga qaraganda kamroq tarqalgan bo'lib, beta qatlamli tuzilmalarga ega bo'lgan ArMlarning de novo dizayni to'liq o'rganilmagan (Williams 1995; Lu va boshq. 2009). SCADS hisoblash vositasi (Kono va Saven 2001) yordamida de novo yondashuv yordamida ishlab chiqilgan ArM misollaridan biri beta-varaqqa boy iskaladan iborat bo'lib, Fe ionlarini bog'lash qobiliyatiga ega bo'lgan rubredoksin RM1 redoks faol biomimetik tizimdir. va teskari tsiklni o'tkazadi. Fe2+ ​​va Fe3+ oksidlanish darajalari o'rtasida va shuning uchun tabiiy ravishda yuzaga keladigan rubredoksinni taqlid qiladi (Vikas Nanda va boshq., 2005).
De novo metalloenzimlarni ishlab chiqish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan turli xil onlayn vositalar mavjud. Rosetta dasturiy ta'minot to'plami afzal qilingan ferment dizayn to'plamlaridan biri bo'lsa-da, boshqa alternativalar ham mavjud. Masalan, ideal teozimni (funktsional guruhlar bilan o‘tish holatini barqarorlashtirish uchun optimal geometriyani hisoblash yo‘li bilan yaratilgan nazariy ferment) mavjud oqsil skafoldiga moslashtirish OptGraft, Scaffold-Selection va ProDA yordamida ham amalga oshirilishi mumkin. SABER dasturi boshqa strategiyadan foydalanadi. Tanlangan oqsillarga ideal faol joyni joylashtirish o'rniga, bu dastur katalitik qoldiqlarni tegishli nisbiy pozitsiyalarda mavjud bo'lgan oqsillarni qidiradi va kamroq mutatsiyalar kiritilishini talab qiladi. De novo yondashuvining asosiy afzalliklaridan biri shundaki, turli xil sun'iy ravishda yaratilgan metallofermentlar g'ayritabiiy metallarni muvofiqlashtirish holatlarini barqarorlashtirish uchun qiziqarli imzo potentsialini namoyish etadi. Ba'zi hollarda, metall kofaktorni bog'lash oqsillarni katlamani va polipeptid strukturasining noto'g'ri katlanmış yoki tasodifiy lasan yoki nisbatan kamroq buklangan holatdan funktsional faol mahalliy holatga qadar yig'ilishini tartibga solishi kuzatilgan. Ushbu yondashuv funktsional faol va strukturaviy jihatdan barqaror bo'lgan turli xil ish stantsiyalarini yaratish uchun katta imkoniyatlarga ega.
Ushbu yondashuvning yagona jiddiy cheklovi oqsillarni katlama mexanizmi haqida ma'lumot etishmasligidir. Natijada, kremniy tarkibidagi metalloenzimni loyihalash dastlabki hisob-kitoblarni talab qiladi (Rosati va Roelfes 2010).
5. Yuqoridan pastga yondashuv
5.1 Mahalliy bioscaffolds yordamida ish stantsiyalarini loyihalash

Mahalliy bioskaffoldlardan foydalangan holda APM dizayni eng ko'p qo'llaniladigan yondashuv bo'lishining sababi shundaki, u de novo dizayn yondashuviga nisbatan juda ko'p afzalliklarni beradi. Quyida ushbu imtiyozlardan ba'zilari keltirilgan:

1. Tabiatda shunga o'xshash yoki to'g'rirog'i, aynan bir xil bioskaffoldlarni turli xil metallofermentlarda topish mumkin, ular ichida sezilarli darajada farq qiluvchi metall kofaktorga ega bo'lgan va turli funktsiyalarni bajaradi. Bundan tashqari, turli xil metallofermentlarda o'xshash/bir xil bioskaffoldlarning mavjudligi, shuningdek, bu tabiiy iskalalarning o'ziga xos tarzda kuch va egiluvchanlikning qiziqarli xususiyatlarini taqdim etishini anglatadi. Bu bioskelalarning tuzilishi va vazifalari talablarga muvofiq osonlik bilan o'zgartirilishi mumkin, ya'ni mahalliy bioskaflar mutatsiyalarga duchor bo'ladi va hatto bir nechta mutatsiyalar tsiklidan keyin ham bu iskala termodinamik barqarorligini va katlama naqshini saqlab qoladi. Bundan tashqari, ushbu strategiyadan foydalanish tadqiqotchilarga bioskaffoldga yangi metall kofaktorni bog'lash joyini kiritishda ferment barqarorligini saqlash bilan bog'liq muammolar va asoratlardan qochish imkonini beradi (Lu va boshq. 2009; Rosati va Roelfes 2010).
2. Hozirgi vaqtda mavjud bo'lgan hisoblash vositalari/ma'lumotlar bazalari, masalan, PDB (Protein ma'lumotlar banki) mahalliy oqsillar uchun mavjud bo'lgan ma'lumotlarga nisbatan yangi ishlab chiqilgan oqsillar haqida cheklangan ma'lumotlarni o'z ichiga olganligi sababli, tadqiqotchilar ko'pincha ArM ni mahalliy iskala yordamida qurishni afzal ko'rishadi (Berman va boshqalar. va boshq. 2000).
3. Tabiatda uchraydigan bioskaflardan foydalanish tadqiqotchilarga tabiatda uchraydigan turli xil bioskarlardan tanlashda katta ustunlik beradi.
4. Yangi ishlab chiqilgan oqsil iskalalaridan farqli o'laroq, tabiiy oqsil iskalalari osonlikcha kristallanadi, bu protein iskalalarini strukturaviy (3D) aniqlash imkonini beradi (Lu va boshq. 2009).
5. Protein iskalalarini funksional xarakterlash uchun saytga yo'naltirilgan mutagenezdan foydalanish mumkin. Misol uchun, odatda saqlanib qolgan hududlarga kiritilgan nokaut/funksiyani yo'qotish mutatsiyalari muayyan funktsiya uchun mas'ul bo'lgan asosiy biomolekulyar belgilarni aniqlashga olib keladi (Lu va boshq. 2009).
5.1.1 Bioskaffolddagi faol joy/metall kofaktor bog'lanish joyini qayta loyihalash
Metall bog'lash joyini qayta loyihalashdan maqsad yoki yangi funksionallikni ta'minlash yoki metall kofaktorning oqsil iskala bilan bog'lanishi uchun o'ziga xoslikni ta'minlashdir. Metallofermentlarni qayta loyihalash uchun turli mutagenez usullaridan foydalanish mumkin. Metallofermentga kerakli yangi funktsiyani berish uchun uning metall kofaktorini bog'lash joyini metall fermentning substrat bog'lash joyi bilan birga metall bog'lash joyining geometriyasini o'zgartiradigan tarzda o'zgartirish kerak (Lu va boshq. 2009; Lyuis va Ellis). ). -Gvardiola 2018). Metall fermentlarni metall ionlarini fermentning oldindan mavjud bo'lgan faol joyiga bog'lash uchun xarakterli tendentsiyaga ega bo'lgan aminokislotalar qoldiqlarini kiritish orqali muvaffaqiyatli qayta tuzilishi mumkin, bu dastlab metallni bog'lovchi oqsil bo'lishi mumkin yoki bo'lmasligi mumkin. Protein iskalasiga kiritilgan yangi metall bog'lanish joylari tabiatda mononuklear, gomonukulyar yoki geteronuklear bo'lishi mumkin. Heteronuklear joylar tabiiy ravishda lignin tolalarining parchalanishi, azot oksidining kamayishi va boshqalar kabi biologik funktsiyalarni bajaradigan ko'plab oqsillarda topilgan. Heteronuklear joylarni loyihalash gomonuklear metallni loyihalash bilan solishtirganda ancha qiyinroq vazifa ekanligi kuzatildi. bog'lovchi saytlar. bir nechta metall kofaktorlarni aniq lokalizatsiya qilish va bog'lash talabi tufayli. Heteronuklear metallni bog'lash joyini loyihalash va uni oqsil bioskaffoldiga kiritish odatda kompyuter yordamida loyihalash yondashuvi bilan yordam beradi. Metall klasterlarni yoki ikki yadroli metallni bog'lash joylarini oqsil tarkibiga kiritish orqali metalloenzimlarni qurishda qiyinchiliklar ko'pincha paydo bo'ladi. Ikki yadroli metallni bog'lash joyini joriy etishning bu jarayoni asosan qo'llash orqali erishiladi. Saytga yo'naltirilgan halqa mutagenezi (Franklin va Welch, 2005; Greisen va Khare, 2014; Jeschek va boshqalar, 2018). Odatda, metallni bog'lash joyini qayta loyihalash maqsadli oqsil va shablon oqsili o'rtasida mavjud bo'lgan strukturaviy farqlarga asoslanadi. Ushbu strategiya odatda oldingi tajriba va bilimlarga asoslangan empirik dizayn yondashuvi, hisoblash vositalari va bioinformatikadan foydalangan holda oqilona dizayn yondashuvi yoki kombinatsion tanlov yondashuvi bilan belgilanadi (Lu va boshq. 2009).
Qayta loyihalash strategiyasi: Foyda
1. Ushbu strategiya bilan bog'liq asosiy afzallik shundaki, u funktsiyani kuchaytirish yoki har qanday o'zgartirishda rol o'ynashi mumkin bo'lgan ma'lum bir metalloenzimda mavjud bo'lgan protein skafoldining strukturaviy xususiyatlarini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin (1-jadval).
2. Ushbu strategiya bilan bog'liq yana bir afzallik shundaki, faol saytni qayta loyihalash orqali ta'minlangan ma'lum bir metall ioniga bog'lanishning selektivligi metall sensorlar kabi metallni aniqlash dasturlarida qo'llanilishi mumkin (Lu va boshq. 2009; Hu va boshq. 2014). .
3. Kovalent bo'lmagan o'zaro ta'sirlar bilan bog'liq murakkablik tufayli oqsil-oqsil o'zaro ta'sirini tushunishning cheklanganligi bu o'zaro ta'sirlarni nazorat qilish imkonini bermadi. Metallofermentlarning faol joyini loyihalash oqsil-oqsil o'zaro ta'sir mexanizmini tushunishga yordam beradi, shuningdek, ushbu o'zaro ta'sirlarni tartibga solishga imkon beradi (Lu va boshq. 2009; Yu va boshq. 2014).

5.1.2 Yangi faol saytga kirish

Metall kofaktorni bog'lash uchun hech qanday cho'ntak bo'lmagan bioskaffoldga yangi faol saytni kiritish mahalliy bioscaffoldlardan foydalangan holda APMlarni qurishning muqobil strategiyasidir. Murakkabligiga qaramay, ushbu yondashuvni juda muhim strategiya deb hisoblash mumkin, chunki u maqsadli oqsilda ham, matritsa oqsilida ham (metall bog'lanish joyi kiritilishi kerak) mavjud bo'lgan umumiy strukturaviy xususiyatlarning ekstrapolyatsiyasi cheklanishini engib o'tadi. mumkin emas. metall ionlarini bog'lash joyining strategiyasi o'zgargan taqdirda.
Metall bog'lash joyini joriy qilishning keng tarqalgan usuli shablon va maqsadli oqsil tuzilmalarining homologiyasi asosida faol saytni loyihalashdir. Strukturaviy homologiya bo'lmaganda, SWISS-MODEL, MODELER, PHYRE va METAL-SEARCH kabi hisoblash loyihalash vositalari ko'pincha qo'llaniladi.
Ushbu yondashuvdan foydalanishning asosiy afzalligi shundaki, u ishlatilishi mumkin bo'lgan bioskaffoldlar uchun mavjud variantlarni sezilarli darajada kengaytiradi. Biroq, yangi ishlab chiqilgan metall bog'lash joyining kiritilishi oqsil bioskaffoldining barqarorligi va katlama konfiguratsiyasiga qanday ta'sir qilishini oldindan aytib bo'lmaydi, chunki bunday kirish hatto molekulalararo va/yoki molekulyar o'zaro ta'sirlarning o'zgarishiga/buzilishiga olib kelishi mumkin (Lu va boshqalar 2009; Rosati va Roelfes 2010; Bos va Roelfes 2014).
5.2 Yangi aminokislotalarni kiritish orqali yangi metallofermentlarni loyihalash
Mahalliy bioscaffoldlarning rivojlanishi yangi AWPlarni sintez qilish imkonini bergan samarali vositalardan biridir. Biroq, ArM ning rivojlanishidagi asosiy maqsadlardan biri yangi funktsiyalarga ega fermentlarni yaratish bo'lganligi sababli, bu tabiiy ravishda paydo bo'lgan metalloenzimlarning oqsil iskalalarida topilmaydigan yangi aminokislotalar qoldiqlarini kiritish uchun ushbu yondashuvga olib keldi (Lu 2005). Quyida yangi funksiyalarga ega ish stansiyalarini loyihalashda foydalaniladigan asosiy usullardan (5-rasm) keltirilgan:
1. Qattiq faza sintezi: Ushbu metodologiyadan foydalangan holda bioskaffoldlarni loyihalash oqsil iskalasini to'liq sintez qilish imkonini beradi. Bu usul har qanday sun'iy aminokislota qoldiqlarini kiritish imkonini beradi. Ushbu strategiyaning asosiy cheklovlari o'lcham va xarajat cheklovlarini o'z ichiga oladi, bu esa dizaynda ushbu usuldan foydalanishni cheklaydi. Uzunligi 60-100 aminokislotadan oshmaydigan oqsillar (Merrfield 1997; Lu va boshq. 2009).
2. Mahalliy kimyoviy bog'lanish: Bu strategiya sun'iy peptidlar o'rtasida kovalent o'zaro ta'sirlarni shakllantirishga asoslangan. Ushbu strategiya kattaroq oqsillarni ishlab chiqarish uchun qabul qilinishi mumkin, ammo iqtisodiy samaradorlik hali ham katta hajmli oqsillar uchun muammo bo'lib qolmoqda (Dawson va boshq., 1994).
3. Ekspresslangan oqsil ligatsiyasi. Bu usul mikrob hujayralaridan, masalan, bakteriyalardan rekombinant oqsillarni ishlab chiqarishni, shuningdek, konjugatsiyani o'z ichiga oladi. sun'iy oqsil/peptid zanjiri bilan ifodalangan polipeptid zanjiri, bu boshqa strategiya (masalan, kimyoviy sintez) yordamida olingan tabiiy bo'lmagan aminokislotalarning birikmasidir. Ushbu strategiya juda katta oqsillarni ishlab chiqarish bilan bog'liq xarajatlarni sezilarli darajada kamaytirdi, ammo bu texnikaning kamchiliklari shundaki, u ko'pincha ligatsiya joyida sistein qoldig'ining mavjudligini talab qiladi. Sisteindan tashqari aminokislotalar ham ligatsiya samaradorligini oshirish uchun o'rganilgan, ammo ular ko'pincha kamroq ligatsiya samaradorligini ta'minlaydi (Muir 2003).
4. Amber kodonini bostirish usuli: Bu usul in vivo va in vitro translatsiyasi uchun ortogonal tRNK va/yoki aminoatsil transfer RNK sintazasiga asoslangan amber to'xtash kodon "UAG" ketma-ketligini tanib olishni va yangi, tabiiy bo'lmagan aminokislotalar qoldiqlarini kiritishni o'z ichiga oladi. . oqsil iskala ichiga (Noren va boshq., 1989; Vang va boshq., 2001; Lu va boshq., 2009; Jeschek va boshq., 2018).
5. Boshqa usullar: auksotrofni rivojlantirish (Ikeda va boshq. 2003), aminokislotalar qoldiqlarini kimyoviy modifikatsiyalash (Dongfeng Qi va boshq. 2001), bo'shliqni to'ldirish (Barrick 1995) oqsil uzunligi bilan cheklanmagan ba'zi usullardir. Biroq, bu usullar samarali kiritilishi mumkin bo'lgan aminokislotalar nuqtai nazaridan nisbatan kamroq universaldir (Lu va boshq. 2009).
Tabiiy bo'lmagan aminokislotalar yordamida APMni ishlab chiqish: foyda
1. Ushbu strategiya oqsil tarkibiga kiritilgan individual aminokislotalar qoldiqlarining rolini va ularning sun'iy ravishda yaratilgan metallofermentlarning katalitik faolligi va reaktivligiga ta'sirini, shuningdek, bu ferment tomonidan katalizlanadigan reaktsiyaga qanday ta'sir qilishini o'rganish uchun qo'llanilishi mumkin. Misol uchun, dekstro enantiomerni chap enantiomer bilan almashtirish muhandislik ArM tuzilmalari o'rtasida aniq tartibga solishni ta'minlashi aniqlandi.
2. Tabiiy bo'lmagan aminokislota qoldiqlarining kiritilishi oqsil bilan bog'liq bo'lgan qaytarilish potentsialini o'zgartirishda rol o'ynaydigan hidrofobik qoldiqlarni tan olishga vositachilik qiladi, bu esa tabiiy oqsillarga qaraganda kattaroq reduksiya potentsialiga ega bo'lgan yangi metallofermentlarning hosil bo'lishiga olib keladi. .
3. Tabiiy bo'lmagan aminokislotalarni o'z ichiga olgan holda qurilgan bioskaffoldlar mahalliy iskalalarga nisbatan sezilarli afzalliklarni ta'minlaydi, chunki bu iskala metalloenzimlarda tabiiy ravishda yuzaga kelmaydigan metall kofaktorlarini kiritishga mos keladi (Lu va boshq. 2009).
6 Yakunlovchi fikrlar
Yaxshi ishlab chiqilgan AWP aniq geometrik konfiguratsiya bilan birga birlamchi muvofiqlashtirish sohasining sterik moslik xususiyatlarini o'z ichiga olishi kerak. Protein dizayni sohasida sezilarli yutuqlarga erishilgan bo'lsa-da, bugungi kunda tizimli barqaror va funktsional barqaror oqsilni yaratish juda qiyin.