Экзоны и интроны Открытие прерывистой структуры гена

Экзоны и интроны
Открытие прерывистой структуры гена . Прерывистая структура эукариотических генов и явлений сплайсинга были открыты при детальном изучении структуры генома аденовируса 2, одного из вирусов, содержащих ДНК.
Геном аденовируса - это линейная ДНК размером около 36 000 п. н. (36 т. п. н.); он содержит несколько десятков разных генов, кодирующие последовательности которых расположены в обеих цепях ДНК. На поздних стадиях инфекции клеток вирусом, незадолго до лизиса клеток, в основном транскрибируется одна из двух цепей ДНК ("поздняя", или "L-цепь"), в которой находится не менее пяти генов, кодирующих белки, входящие в состав зрелого вируса (рис. 4). Эти гены рассеяны по всей длине L-цепи аденовируса.

Рис. 4. Строение различных мРНК, синтезируемых на 'поздней цепи' генома аденовируса 2. а - карта транскрипции. Видно, что поздние мРНК образуются из пяти областей вирусного генома. Однако, кроме того, каждая из этих мРНК содержит на своем 5'-конце по три последовательности, происходящие из участков, лежащих на 16,6; 19,6 и 26,6 ед. карты. Эти три участка образуют лидер, входящий в состав каждой мРНК, участки между лидерными отрезками и между лидером и 'телом' мРНК являются нитронами и удаляются в результате сплайсинга. Наверху представлен гигантский первичный транскрипт поздней аденовирусной про-мРНК. Из него за счет формирования разных 3'-концов и разного сплайсинга образуется по крайней мере 13 разных мРНК (по одной из одного первичного транскрипта); б - электронная микроскопия гибрида между поздней (L) цепью аденовирусной ДНК и мРНК, гибридизующейся с областью 67-79 (см. карту); в - схема, объясняющая структуру гибрида. Видно, что мРНК связывает четыре области вирусной ДНК, в результате чего образуются три петли ДНК, соответствующие трем интронам (1, 2, 3) (по результатам, полученным Р. Робертсом, Ф. Шарпом, Т. Брокером, Дж. Дарнеллом и др.)
Две группы в лаборатории Колд-Спринг-Харбор (США) изучали структуру поздних мРНК аденовируса и неожиданно обнаружили, что все они начинаются с одной и той же короткой последовательности, т. е. 5'-конец у всех пяти мРНК был одинаковым (см рис. 4). Далее оказалось, что эта последовательность не соседствует с поздними генами, а выявляется в левой части аденовирусного генома на значительном расстоянии от них. Более того, эта "лидерная последовательность" гибридизовалась с тремя разными участками левой половины генома. Особенно четко такая структура мРНК выявляется при изучении гибридов между мРНК и ДНК аденовируса в электронном микроскопе. На электронных микрофотографиях отчетливо видно, что каждая поздняя мРНК аденовируса образует гибриды с четырьмя разными участками аденовирусного генома: тремя короткими, расположенными в его левой части, и одним длинным (собственно геном). В то же время появились данные, что главным первичным продуктом транскрипции аденовирусного генома на поздних стадиях инфекции является длинная РНК, считываемая почти со всей L-цепи.
Учитывая все это, единственным объяснением странной структуры аденовирусных мРНК являлось допущение, что вначале идет непрерывная транскрипция генома, образуется длинный предшественник мРНК (про-мРНК), затем из этой про-мРНК вырезаются внутренние участки, а образовавшиеся концы соединяются, связываются (см. рис. 4).
В 1977 г. этот вывод казался совершенно парадоксальным, не вытекающим из каких-либо теоретических предпосылок. Однако эксперимент был настолько ясен, что он был безоговорочно принят на симпозиуме 1977 г. в Колд-Спринг-Харбор, посвященном хроматину. Стало ясным, что по крайней мере гены аденовируса складываются из нескольких несоседствующих блоков, названных позднее экзонами. Экзоны, в свою очередь, разделены блоками ДНК, не выявляемыми в зрелой мРНК. Последние были названы нитронами.
Новообразующаяся про-мРНК считывается непрерывно и поэтому содержит в своем составе и экзоны и интроны. Затем интроны вырезаются из про-мРНК, а концы экзонов соединяются. Это явление получило название сплайсинга.
Дальнейшее изучение транскрипции и сплайсинга поздних генов аденовируса позволило уточнить детали этого процесса. Транскрипция всегда начинается с первого экзона и кончается после прохождения РНК-полимеразы почти вдоль всего генома аденовируса. Затем в про-мРНК вносится разрыв сразу после одного из пяти генов, что и определяет судьбу про-мРНК. При сплайсинге удаляются интроны между 1-м и 2-м лидерами, между 2-м и 3-м лидерами и, наконец, весь отрезок про-мРНК между 3-м лидером и началом последнего экзона. Если, скажем, цепь оборвалась после третьего экзона, то экзоны, соответствующие двум первым генам, удаляются, т. е. в этом случае они являются частью большого третьего интрона (см. рис. 4).
Почти сразу после открытия экзон-интронной структуры гена у аденовируса аналогичное явление было обнаружено и у другого вируса, содержащего ДНК, обезьяньего вируса 40 (или SV40). Поначалу можно было думать, что разорванные гены и сплайсинг - это достояние вирусов. Однако уже в том же 1977 г. стало ясно, что разорванная структура генов - явление, распространенное гораздо шире.
Первые результаты были получены на генах β-глобина мыши и овальбумина кур. Оказалось, что фрагменты генома, с которыми гибридизуется мРНК соответствующих генов, в своей сумме намного превышают по размерам длину мРНК. Наиболее информативны данные по сравнению структуры геномного клона, содержащего данный ген, и кДНК-клона, т. е. клона, ДНК которого считана ревертазой с мРНК. В этом случае прямо сравнивается структура гена и мРНК.
Оказалось, что ген, кодирующий β-глобин, занимает у разных видов млекопитающих отрезок ДНК длиной около 1,5 т. п. н. Он состоит из трех экзонов, разделенных двумя интронами (рис. 5). При транскрипции образуется про-мРНК длиной ∼ 1500 нуклеотидов. Она содержит в своем составе последовательности, соответствующие как экзонам, так и интронам. При сплайсинге интроны вырезаются, а три экзона составляют мРНК длиной около 700 нуклеотидов (∼600 нуклеотидов - экзоны + ∼100 нуклеотидов - поли (А)). Интересно, что в случае β-глобинового гена интроны прерывают кодирующую часть гена (между 31-м и 32-м и между 105-м и 106-м кодонами). Этим β-глобиновый ген отличается от описанных выше поздних генов аденовируса, где лидерные последовательности не участвуют в кодировании белка.

Рис. 5. Экзон-интронная структура эукариотических генов. а - β-глобиновый ген млекопитающих (цифры дают вариации размеров экзонов и нитронов). Дано схематическое изображение про-мРНК и зрелой мРНК. Экзон 1 дает 5'-нетранслируемую область (30 нуклеотидов) и кодирует аминокислоты 1-30; экзон 2 кодирует аминокислоты 31-104; экзон 3 - аминокислоты, начиная со 105 до С-конца и 3'-нетранслируемую область; б - 1а2-коллагеновый ген курицы. Он состоит из более чем 50 экзонов (широкие блоки) и нитронов (тонкая линия), занимая в геноме область 38 т. п. н. (по результатам, полученным Р. Флавеллом, Ф. Ледером, Т. Маниатисом, П. Доти, Х. Бедкер и др.)