Экзоны и интроны Открытие прерывистой структуры гена

Почему существуют интроны? [56-58]. Открытие экзонов и интронов дало объяснение первому парадоксу организации генома у эукариот, а именно большим размерам единиц транскрипции, намного превышающим размеры собственно генов. Действительно, на интроны приходятся гораздо больше ДНК, чем на экзоны, и соответственно про-мРНК существенно длиннее, чем зрелая мРНК.
В то же время разорванная структура эукариотических генов была одной из крупнейших неожиданностей в молекулярной биологии. Она не вытекала из каких-либо априорных соображений, а просто явилась неумолимым выводом из результатов эксперимента. Однако, как только она стала совершившимся фактом, начались попытки осмысливания этого явления. Возник вопрос, зачем природе понадобилось вводить сложный процесс сплайсинга, включающего разрывы и соединения концов РНК и уничтожение трех четвертей синтезированной про-мРНК, вместо того чтобы просто иметь непрерывные гены, как в случае прокариотических организмов.
Остановлюсь на ряде высказанных в разное время гипотез. Прежде всего возникла идея, что сплайсинг с его способностью объединять разъединенные отрезки ДНК в один ген может играть важнейшую роль в эволюции, в частности в объединении разных генов в один и, следовательно, разных полипептидных цепей в одну. Тем самым сравнительно легко могут возникать новые гены. Эти представления находят подтверждение при сравнении экзон-интронной структуры некоторых генов и так называемой доменной структуры соответствующих им белков. Ряд белков состоит из нескольких доменов, т. е. блоков, разделенных структурно и функционально. Классическим примером является фермент ДНК-полимераза I. Хотя она и представлена одной непрерывной полипептидной цепочкой, но состоит фактически из двух разных ферментов: собственно ДНК-полимеразы (синтезирующей ДНК) и экзонуклеазы (разрушающей ДНК с конца). Эти два домена образуют две независимые компактные частицы, связанные между собою коротким полипептидным мостиком. Последний легко разрушается при мягкой обработке протеиназами, когда домены остаются неповрежденными в силу своей компактности. Это ведет к разделению доменов.
В эукариотических организмах белков, состоящих из нескольких доменов, очень много. Оказалось, что в тех случаях, когда в составе белка можно различить несколько доменов, то в гене на границе между отрезками, кодирующими соседние домены, как правило, присутствует интрон. Каждый домен, таким образом, представлен одним или несколькими экзонами. Можно допустить, что когда-то домены были разными генами, но затем в результате мутаций на их границах появились сигналы для сплайсинга и в результате произошло их объединение и создание нового гена. Ярким примером являются гены для мембранных белков рецепторов. У этих белков всегда есть по крайней мере четыре домена:

1. 
   сигнальный пептид, который используется для направления синтезируемого белка в полость эндоплазматического ретикулума (после прохождения туда он отщепляется);
   
2. 
   наружный домен, несущий участок связывания для лиганда, т. е. соединения, к которому имеет сродство данный рецептор;
   
3. 
   трансмембранный домен, гидрофобный отрезок полипептидной цепи, пересекающий мембрану;
   
4. 
   внутренний домен, имеющий сходство у разных рецепторов и обладающий ферментативной активностью (протеин-киназа).
   

Эти домены в составе гена всегда разделены между собою нитронами.

Не менее яркий пример - это гены иммуноглобулинов или гены комплекса гистосовместимости (рис. 8).

Рис. 8. Связь между экзонами и белковыми доменами на примере гена гистосовместимости МНС, класс 1. а - схема доменной структуры зрелого белка, содержащего три наружных домена (a1, a2 и a3), трансмембранный домен (ТМ) и внутриклеточный цитоплазматицеский домен (Cyt). Кроме того, в белке-предшественнике на N-конце находится лидерная последовательность, отщепляемая при образовании зрелого белка; б - экзон-интронная структура гена МНС-1. Видно, что лидерный пептид, домены al, a2, a3 и ТМ кодируются каждый отдельным экзоном, а цитоплазматический домен - тремя экзонами; НТ - нетранслируемые последовательности мРНК
Другой путь создания полидоменного белка - это дупликация (удвоение) какого-то отрезка ДНК, содержащего ген, и последующее соединение двух одинаковых участков в один ген за счет сплайсинга РНК. Дупликация генов или просто неких сегментов ДНК - явление, широко распространенное у эукариот и несомненно играющее очень большую роль в эволюции. Действительно, многие гены представлены в геноме не одной копией, но несколькими, образуя семейство родственных генов. В ряде случаев можно показать, что такие умножившиеся отрезки ДНК объединились в один ген. Хорошим примером является упомянутый выше коллагеновый ген с его многочисленными экзонами и интронами (см. рис. 5). Целая серия экзонов этого гена имеет сходную структуру, кодируя полипептид (глицин-пролин-Х)а, который многократно повторяется в коллагене. Очевидно, небольшой отрезок ДНК, кодирующий этот полипептид, размножился за счет повторных дупликаций, образовав множество экзонов, которые благодаря сплайсингу объединяются в составе коллагеновой мРНК.
Однако далеко не всегда удается связать экзоны с белковыми доменами, а интроны - с междоменными границами. Иногда интрон оказывается, например, внутри 5'- или 3'-нетранслируемой области или внутри области, явно соответствующей одному домену. Поэтому объяснить наличие интронов только полидоменной структурой белка нельзя.
Другое представление, касающееся природы и значения интронов, заключается в предположении о регулятор-ной роли этих последовательностей в экспрессии (работе) генов. Во-первых, в одном и том же гене сплайсинг иногда может протекать по-разному. Примером могут служить так называемые ранние гены вируса SV40, т. е. гены, работающие на ранних стадиях инфекции клеток вирусом. Область ранних генов занимает около половины всего генома вируса, его кольцевой ДНК, имеющей в длину всего 5,2 т. п. н. Оказалось, однако, что "ранняя область" кодирует два разных белка с совершенно различной аминокислотной последовательностью. Это является следствием различного, или альтернативного, сплайсинга, происходящего с одной и той же молекулой про-мРНК. Как отмечалось выше, сигнальные последовательности для сплайсинга вырождены, т. е. довольно разнообразные последовательности в РНК могут выполнять роль таких сигналов. Неудивительно, что в некоторых про-мРНК, например в ранней про-мРНК SV40, присутствует несколько таких сигналов (в данном случае два варианта), которые обусловливают несколько возможных типов сплайсинга одной и той же про-мРНК. В результате для "ранней области" вируса SV40 из одной про-мРНК образуется две разных мРНК, кодирующих два разных полипептида, названных большой Т-антиген (Т) и малый Т-антиген (t). Т означает tumor, т. е. Т-антиген, - это вирусный опухолевый антиген. Такое название эти белки получили потому, что они присутствуют в опухолях, вызванных вирусом SV40, и от них зависят онкогенные свойства этого вируса.
Много примеров альтернативного сплайсинга получено на аденовирусе, где часто из одной и той же про-мРНК образуются по две, три или четыре разных мРНК, кодирующих разные белки (см. рис. 4). Существенно, что при альтернативном сплайсинге часто происходят изменения рамки считывания, т. е. одна и та же нуклеотидная последовательность дает разные аминокислотные последовательности. Для вирусов это особенно важно, так как позволяет более экономно использовать генетический материал, обеспечивает компактизацию генетической информации у вируса. Поскольку для клеточного генома ограничений по размеру не существует, то там явление альтернативного сплайсинга встречается реже и, как правило, рамка считывания сохраняется неизменной. Для многих генов вообще существует только один возможный вариант сплайсинга, и из одной про-мРНК образуется лишь один тип мРНК. Тем не менее и для генов эукариот можно найти много случаев альтернативного сплайсинга, при котором часто (по крайней мере, в случае вирусов) все варианты реализуются с определенной частотой, прежде всего в зависимости от последовательности нуклеотидов на границе экзона и интрона и от места положения сайта сплайсинга.
Использование того или иного типа сплайсинга не является объектом контроля. Однако в некоторых случаях реализуется и такая возможность. Например, у дрозофилы существует генетический элемент (называемый Р-элементом), кодирующий фермент транспозазу, который катализирует вырезание из генома и обратное встраивание в геном Р-элемента. Ген транспозазы состоит из четырех экзонов и трех интронов. При этом в большинстве клеток дрозофилы из про-мРНК вырезаются только два первых интрона, и полученная в результате мРНК не способна синтезировать транспозазу. Только в зародышевых клетках дрозофилы появляется некий дополнительный фактор, который обеспечивает вырезание третьего интрона. В результате только в этих клетках возникает активная транспозаза, что, в свою очередь, проявляется в вырезании из генома и встраивании в геном Р-элемента. В других клетках таких перемещений Р-элемента по геному выявить не удается.
Если искусственно с помощью генноинженерных методик удалить из гена транспозазы третий интрон и ввести такой Р-элемент в геном дрозофилы, то тогда он меняет свое поведение. Зрелая мРНК, кодирующая транспозазу, появляется во всех типах клеток, и в любых клетках организма становятся возможными перемещения Р-элемента.
Иными словами, на этой системе путем контроля процесса сплайсинга осуществляется регуляция активности гена.
Имеются и другие сходные примеры.
Итак, сплайсинг может играть роль в создании новых генов в ходе эволюции, в более полном и экономичном использовании записанной в геном информации и, наконец, в регуляции экспрессии генов. Весьма вероятно, что существуют и другие "приложения" для сплайсинга. Следует, однако, подчеркнуть, что, скорее всего, разорванная структура гена и сплайсинг возникли не в результате перехода от прокариот к эукариотам, но, напротив, они имелись уже у наиболее древних форм жизни, в частности у архебактерий. В настоящее время появляются свидетельства в пользу того, что первичная жизнь существовала в форме РНК, которая была и носителем генетической информации (вместо ДНК), и осуществляла ферментативные функции (вместо белков). Сплайсинг - это как раз тот процесс, который во многих случаях катализируется самой РНК без участия белка даже в современных организмах (см. гл. 6). Неудивительно поэтому, что процессы сплайсинга могли существовать даже у древнейших организмов, а далее они уже использовались для выполнения разных биологических задач.

Рис. 9. Примеры мутаций, ведущие к нарушениям сплайсинга β-глобиновой про-мРНК. и, как следствие, к β-талассемии. а - точечная мутация (G→A) на 5'-границе первого интрона инактивировала донорный (5') сайт сплайсинга. В результате стали использоваться три 'скрытые' сайты сплайсинга и образовываться три 'неправильные' мРНК. В результате синтез (3-глобина не происходит (по результатам, полученным Т. Маниатисом и соавт.);б - точечная мутация (G→A) в первом интроне привела к возникновению в нем сильного донорного сайта сплайсинга, который успешно конкурирует с сайтом правильного сплайсинга. В результате 9/10 всей β-глобиновой мРНК становится дефектной, и синтез β-глобина падает в 10 раз; е - экзоны, i - интроны (по результатам, полученным С. А. Лимборской и соавт.)