Экзоны и интроны Открытие прерывистой структуры гена

Клонирование и структура гена клеточного Т-антигена, или р53^1* [53,54]. Один из этих генов - ген для белка, называемого клеточным опухолевым антигеном (клеточным Т-антигеном) или, более кратко, р53. Последний термин обозначает, что это белок (protein) с молекулярной массой 53 000. Белок этот интересен тем, что его содержание повышено во многих опухолях млекопитающих (мышь, человек). Он относится к классу ядерных белков - локализуется в клеточном ядре и обладает способностью связываться с ДНК. Впервые клонирование гена, кодирующего р53, было осуществлено П. М. Чумаковым в нашей лаборатории. Поскольку клонирование слабо экспрессируемого гена является довольно сложной работой, я привожу основные этапы клонирования.
Так как, по расчетам, мРНК для белка р53 должна была составлять не более 0,01 % от всей мРНК, то тотальную мРНК клеток опухоли SVT2 мыши вначале обогащали по р53-мРНК. Для этого выделяли из клеток мРНК, ультрацентрифугировали ее в сахарозном градиенте, собирали фракции РНК и вели на каждой из них синтез белка in vitro, добавляя в смесь меченую аминокислоту, метионин-[35S]. Из инкубационной смеси осаждали белки антителами к р53 и после электрофореза определяли появление меченого белка, имеющего ту же подвижность, что и р53. Фракции, которые содержали мРНК, обеспечивающие синтез р53, собирали и использовали для синтеза на них комплементарной ДНК (кДНК) с помощью фермента ревертазы (см. разд. 1.7). Синтезированную двухцепочечную ДНК встраивали в плазмиду и клонировали. Затем проводили поиск колоний, содержащих ДНК гена р53. С этой целью из клона выделяли ДНК и на эту ДНК вылавливали соответствующую ей мРНК путем гибридизации. Далее, на отловленной мРНК синтезировали меченый белок и определяли его природу с помощью антител к белку р53, как описано выше. Из примерно 100 проверенных таким образом клонов был получен один, содержащий ДНК, которая связывала мРНК для белка р53. Используя меченую ДНК полученного клона как зонд для гибридизации, вели поиск других клонов, содержащих другие части гена р53 мыши. Для этого вели гибридизацию меченой ДНК прямо с колониями бактерий, перенесенными и выращенными на фильтре (см. разд. 1.7). В результате было поймано еще несколько клонов и входящие в них вставки вместе перекрыли почти всю мРНК для гена р53. Так было осуществлено клонирование полной кДНК, или экзонной части гена р53. Вскоре после этого клонирование гена р53 было осуществлено и рядом других авторов.
Чтобы выделить геномный клон р53, использовали "библиотеки" клонированных фрагментов тотальной ДНК мыши или человека. ДНК фрагментировали рестриктазами и встраивали в бактериофаг X, которым затем заражали бактерии. Образовывалось множество бляшек. С ними гибридизовали ДНК ранее полученных клонов и таким образом находили колонии фагов, содержащие ген р53. В результате были изолированы полные геномные копии гена р53 мыши и человека. Сравнение между собою геномных и кДНК клонов позволяет выяснить экзон-интронную структуру гена. Такая работа была проделана почти одновременно в ряде лабораторий, в том числе в нашей В. Л. Бухманом и Н. Н. Нинкиной, которые анализировали ген р53 человека (рис. 6). Видно, что этот ген содержит 11 экзонов и 10 интронов.
В мРНК различают три главных области - кодирующую, с которой считывается белковая последовательность, а также две нетранслируемые области - 5'-концевую и 3'-концевую.
В гене р53 вслед за начальным экзоном, который весь входит в состав 5'-нетранслируемой области, идет очень большой интрон длиной 10,4 т. п. н. Остальные 10 экзонов расположены гораздо ближе друг к другу: длина интронов варьирует от 81 п. н. до 2,5 т. п. н., а экзонов - от 22 п. н. до 1260 п. н. (последний экзон). Маленькие экзоны выявляются лишь путем определения нуклеотидной последовательности кДНК и геномной ДНК. Таким образом, общий размер гена равен ~18,3 т. п. н., из которых на экзоны приходится ∼2,6 т. п. н. В результате про-мРНК примерно в 7 раз длиннее, чем зрелая IMPHK. Интересно, что ген р53 мыши, хотя и отличается от человеческого по нуклеотидным последовательностям, особенно в интронах, имеет точно такую же организацию. В нем также некодирующий белок экзон отделен очень большим (6,3 т. п. н.) интроном от кластера из 10 кодирующих экзонов. Интроны располагаются в тех же самых местах, что и у гена мыши. Таким образом, общая структура гена весьма консервативна.

Рис. 6. Экзон-интронная структура онкогена р53 человека Экзоны даны широкой линией и буквой Э с номером экзона. Указан первичный транскрипт и зрелая мРНК (по результатам, полученным В. Л. Бухманом, О. П. Самариной и др.)
В ходе клонирования геномных копий было получено два варианта клонов, различающихся между собою по рестриктной карте. Они представляют собою два аллельных варианта гена р53, встречающихся в человеческой популяции. Оба варианта кодируют полноценный белок, хотя даже в аминокислотной последовательности белка имеются небольшие различия.
Клонирование гена и определение его структуры является обычно первым шагом по пути выяснения функционирования гена и регуляции его активности. В случае р53 использование клонированного гена позволило отчасти пробить свет и на функцию самого белка р53. Р. Вайнберг и ряд других ученых в США показали, что при введении этого гена в нормальные клетки и его последующей активной работе (синтезе мРНК и белка) клетки претерпевают ряд изменений, характерных для опухолевых клеток. Они становятся "бессмертными", т. е. приобретают свойство неограниченно размножаться при выращивании вне организма, в культуре клеток. На основе этих опытов ген р53 был отнесен к онкогенам, т. е. генам, изменения в которых могут вести к раковому превращению клеток.