Экзоны и интроны Открытие прерывистой структуры гена

Клонирование и структурная организация гена эстеразы S дрозофилы (D. virilis)^1* [55]. Другой ген, проклонированный в нашей лаборатории, - это ген для фермента эстеразы S дрозофилы (D. virilis), который был открыт и хорошо изучен в Институте биологии развития АН СССР Л. И. Корочкиным. Интересной особенностью гена является то, что его продукт, эстераза S, синтеризуется только в одном типе клеток - эпителиальных клетках семявыносящих луковиц дрозофилы, т. е. он относится к генам, участвующим в дифференцировке клеток.
Клонирование гена было осуществлено в нашей лаборатории Г. Н. Ениколоповым в сотрудничестве с Б. И. Кузиным (лаборатория Л. И. Корочкина). Стратегия клонирования была другая, чем в случае гена р53. Она базировалась на знании локализации гена в хромосомах и места экспрессии гена. Во-первых, как отмечалось выше, синтез эстеразы S идет исключительно в семявыносящих луковицах. Предварительные оценки показывали, что до 10 % всего вновь образующегося белка в этом органе составляет эстераза S. Можно было ожидать поэтому, что концентрация мРНК для эстеразы S в семявыносящих луковицах будет очень высокой (не менее 1 %) и поэтому хотя бы один клон из 100, гибридизующихся с мРНК (или синтезированной на ее матрице кДНК), будет содержать нужный ген.
Исходя из этого, вначале получали клоны, содержащие фрагменты геномной ДНК D. virilis. Далее, на мРНК из семявыносящих луковиц синтезировали с помощью ревертазы меченую ДНК и гибридизовали ее с колониями. Те колонии, ДНК которых активно связывала метку, наращивали, выделяли из них ДНК, метили ее и гибридизовали с препаратами политенных хромосом слюнных желез личинок D. virilis.
В некоторых органах дрозофилы, в частности в слюнных железах личинок, удвоение ДНК не сопровождается делением клеток. В результате каждая хромосома содержит не одну - две гигантские молекулы ДНК, но несколько тысяч нитей ДНК, лежащих строго параллельно друг другу,- образуются огромные политенные (многонитчатые) хромосомы. Вариации в степени конденсации ДНК создают в них чередования плотных участков, дисков, и междисковых промежутков (их около 6000). Все области хромосом и диски имеют свои обозначения. Проводя гибридизацию меченой РНК и ДНК с фиксированными препаратами политенных хромосом, ДНК которых денатурирована, и определяя места связывания метки по засвечиванию фотоэмульсии, которой покрывают хромосомы, можно точно определить, в каком месте хромосомы расположен тот или иной ген. Локализация гена эстеразы на политенных хромосомах была уже выяснена ранее Л. И. Корочкиным в генетических опытах. Ген был расположен в районе 2Ge5 второй хромосомы. Таким образом, если ДНК клона (проведенного уже через тест гибридизации с мРНК из семявыносящих луковиц) свяжется с областью 2Ge5 второй хромосомы, то с очень большой вероятностью этот клон будет содержать эстеразный ген. Действительно, из 50 отобранных на первом этапе клонов два связались с областью 2Ge5, и один из них содержал ген эстеразы S.
Однозначное доказательство было получено при инъекции ДНК клона в ядра овоцитов лягушки. Этот тест был впервые введен в практику М. Бирнстилом (Швейцария) для изучения регуляции транскрипции. Введенная в овоцит лягушки чужеродная ДНК становится там матрицей для синтеза мРНК, а на последней в цитоплазме овоцита активно синтезируется белок. Действительно, после введения ДНК клона в ядра овоцитов лягушки в последних начинался активный синтез эстеразы S дрозофилы, которую далее выявляли с помощью иммунологического теста.

Рис. 7. Экзон-интронная структура гена эргеразы S Drosophila virilis. Экзоныьаны жирной линией и обозначены буквой Э с номером (по результатам, полученным Г. Н. Ениколоповым и соавт.)
Имея геномный клон эстеразы S и соответствующую мРНК, Г. Н. Ениколопов сравнил их путем гибридизации мРНК с фрагментами ДНК и тем самым проанализировал экзон-интронную структуру гена, представленную на рис. 7. Из последнего видно, что ген состоит из двух экзонов, разделенных небольшим интроном. Вообще, обычно размеры интронов у насекомых меньше, чем у позвоночных.
С помощью клонированной последовательности была изучена транскрипция гена эстеразы S. Оказалось, что содержание мРНК для эстеразы S в клетках семявыносящих луковиц по крайней мере на три порядка выше, чем в других клетках дрозофилы. Те редкие транскрипты, которые (выявляются в других клетках, начинаются с точек, отличающихся от места старта главного транскрипта семявыносящих луковиц. Таким образом, только в дифференцированных клетках идет активная экспрессия гена эстеразы S.