Фармамакологик биокимё

Машғулот 19.
Биомембраналарда липидларнинг пероксидланиш оксидланиш
тезлигини ўрганиш.
Реактивлар.
1. Трис-НСl буфери, 0,04 м рН.7,4*;
2. Мор тузи-Fe (NH
4
)
2
(SO
4
)
2,
4.10
-5
м –янги тайёрланган эритма;
3. Аскорбин кислотаси, 2,6 мМ янги тайёрланган эритма;
4. Учхлор сирка кислотаси (ТХУК), 40% -ли эритмаси;
5. Тиобарбитурат кислотаси, 0,8 % -ли янги тайёрланган эритмаси;
6. Натрий оксалати, 1,34 % -ли эритмаси;
7. Натрий хлорид, 0,9 % - ли эритмаси;
8. Калий хлорид, 1,2 % эритмаси.

---

Жиҳозлар. Пробиркалар; 0,1; 1 ва 5 мл хажмидаги пипеткалар; пастер
пипеткалари; резинали груша; сув ҳаммоми термометр билан; аптека
тарозуси; СФ ёки ФЭК КФК-типидаги.
Текшириш материали: Қон,- натрий оксалат эритмаси билан, нисбати
ҳажми бўйича 10:1; хайвон янги жигари.
А) Липидларнинг пероксидли оксидланиш тезлигини эритроцитлар
мембранасида наиқлаш.
Услуб асоси. Услуб липидлар пероксидланишини охирги унумли бўлган
малон диальдегидини тиобарбитурат кислотаси билан 530-532 нм нур
ютувчи пушти рангли триметин комплекс ҳосил қилишига асосланган.
Эритма ранги малон диальдегиди концентрациясига пропорциональ.
Экстинкция моляр коэффициенти 1,56.10
5
л –моль
-1
-см
-1

---

Ишнинг бажарилиши. Оксалатли қонни 10 мин 3000 айланиш/мин
центрифугалаб, эритроцитлар чўктирилади. Юқори суюқ қавати сўриб
олиниб, эритроцит чўкмаси натрий хлорид эритмаси билан 3 марта ювилиб,
кўрсатилган йўл билан яна центрифугаланади. 0,5 мл эритроцит чўкмаси тоза
центрифуга пробиркасига олиниб, тенг хажмда дистилланган сув солинади ва
30 мин.га тўла гемолиз учун қолдирилади. Намуна 30 мин давомида 3000
айланиш/мин центрифугаланиб, пастер пипеткаси билан чўкма усти
суюқлиги эритроцитлар мембранаси кулранг қавати биргалигида асталик
билан бошқа пробиркага сўриб олинади.
Учта тоза пробирка олиниб, биринчисига 0,3 мл дан мор тузи эритмаси, трис
буфер, аскорбин кислотаси ва 0,1 мл олинган эритроцит мембранаси
суспензияси солинади. Иккинчисига 0,3 мл трис буфер 0,1 мл эритроцит
мембранаси суспензияси ва 0,6 мл дистилланган сув қуйилади.
Учинчисига (контроль) биринчи пробиркага солинган реактивлар қуйилиб,
тезликда 1 мл ТХУК қўшилади.
Ҳамма пробиркалар сув ҳаммомига жойлаштирилиб, 20 мин. 37
0
С да
инкубацияланади. Сўнгра тажрибавий пробиркаларга (1,2 пробиркалар)1 мл
дан ТХУК қўшилиб, реакция тўхтатилади. Ҳамма пробиркалар 15 мин 3000
айланиш/мин центрифугаланиб, чўкма усти суюқлиги (хажми 2 мл) учта
бошқа пробиркаларга қуйилиб, 1 мл дан тиобарбитурат кислотаси қўшилади
ва намуналар 10 мин қайнаб турган сув ҳаммомида сақланади, сўнгра
пробиркалар музли сувда совитилиб, экстиникцияси контрольга нисбатан СФ
да 532 нм да ёки ФЭК да (кўк светофильтрда) қалинлиги 1 см ли кюветада
ўлчанади.