Pharmaceutical Microbiology Manual

F
OOD AND 
D
RUG 
A
DMINISTRATION
 
O
FFICE OF 
R
EGULATORY 
A
FFAIRS
 
Office of Regulatory Science
 
Document Number: 
ORA.007 
Revision #: 02 
Revised: 
25 Aug 2020 
Title:
Pharmaceutical Microbiology Manual 
Page 49 of 92
For the most current and official copy, check QMiS. 
2. Absorbance values of the media reference standard ([S
3
]) are 
predetermined per antibiotic. Refer USP <81> for testing parameters and 
acceptable data requirements.
Primary and working cultures should be identified with the microorganism 
specie name, ATCC (American Type Culture Collection) number and 
preparation and expiration date. Recommended storage requirements for 
primary and working inoculum stock are specified in USP <81>. To reduce 
assay variability, a primary stock culture of ≤ 14 days should be used to 
prepare a working stock culture; also, a working stock culture of ≤ 7 days 
should be used to prepare a test inoculum. The test microorganism bioactivity 
is known to decrease over time and adjustments to the test inoculum volume 
may be required to meet testing acceptance criteria (e.g. ZOI diameters 
between 14-16 mm as exhibited by the median reference standard ([S
3
]).
Therefore, to reduce assay variability, it 
is recommended to use fresh (e.g. ≤ 2 
day old) primary and working cultures when possible. 
D. Antibiotic Reference Standards ([S
1
] – [S
5
]) and Unknown Sample (U
3
]) 
Preparation 
Antibiotic potency testing requires the use of a standard curve to test an 
unknown sample. The reference standard (RS) must be from a verified source 
such as U.S. Pharmacopeia (USP). Procedures for reference standard 
preparation can be found in USP <81>. A single RS will be used to prepare a 
five-point ([S1] – [S5]) standard curve. Typically, the five standard solutions 
increase in concentration by a ratio of 1:1.25. For example, [S1] – [S5] 
standards can be represented in test as the following standard concentrations: 
6.40 µg/mL, 8.00 µg/mL, 10.0 µg/mL, 12.5 µg/mL and 15.6 µg/mL. See 
Diagram 1 for further details. Labeling accompanying the RS will contain 
preparation, storage and expiration information; this information contains 
specific handling instructions and should be followed in order to achieve 
reproducible and reliable potency test data. A new standard curve must be 
prepared each day of inoculum verification (i.e. test plates) and/or each of the 
three independent test runs.
Antibiotic potency samples will vary in physical form, dose and administration; 
examples of differing sample types include tablets, powders, solutions or semi-
solids. Regardless of these physical and chemical attributes, the test sample 
and reference standard must be diluted prior to testing. Each dilution for the 
test sample and reference standard must be considered. The dilution factor 
(for each dilution) and the total dilution (for multiple dilutions) are data required 
to calculate potency.

---