Pharmaceutical Microbiology Manual

FFICE OF 
R
EGULATORY 
A
FFAIRS
 
Office of Regulatory Science
 
Document Number: 
ORA.007 
Revision #: 02 
Revised: 
25 Aug 2020 
Title:
Pharmaceutical Microbiology Manual 
Page 55 of 92
For the most current and official copy, check QMiS. 
Diagram 5. Example of operations conducted prior, during and after testing 
using the Pate (Diffusion) Method (Hewitt and Vencent 1989).
G. Antibiotic Potency Testing: Tube Method 
Of the two USP <81> methods, the Tube Method is less commonly used. The 
tube method uses a liquid medium (growth broth) to demonstrate antibiotic 
activity. This method requires the use of a test antibiotic/unknown [U3], five-
point (minimum) standard curve ([S1]-[S5]) and verified inoculum. Growth 
inhibition is measured by qualified laboratory personnel with the use of a UV-
VIS spectrophotometer. Test antibiotic will be analyzed in triplicate over a 
period of three independent test runs. Refer to USP <81> for Tube Method 
procedures. 

---

F
OOD AND 
D
RUG 
A
DMINISTRATION
 
O
FFICE OF 
R
EGULATORY 
A
FFAIRS
 
Office of Regulatory Science
 
Document Number: 
ORA.007 
Revision #: 02 
Revised: 
25 Aug 2020 
Title:
Pharmaceutical Microbiology Manual 
Page 56 of 92
For the most current and official copy, check QMiS. 
Test antibiotic/unknown [U3] tubes will contain the growth broth, inoculum and 
the test antibiotic/unknown [U3] in triplicate. The standard curve ([S1]-[S5]) 
tubes will contain the growth broth, inoculum and each of the respective 
standard curve concentrations [S1], [S2], [S3], [S4], and [S5] in triplicate. The 
QC tubes will contain additional median reference standard [S3], will be used 
to perform preliminary absorbance checks and serve as a quality check for 
diluents and inoculum used in test. See Diagram 6 for an example of one 
independent test run for the Tube Method and placement of the standard curve 
and unknown sample into triplicate tubes. 
Diagram 6. An example of one independent test run for the Tube Method and 
placement of the standard curve and unknown sample into triplicate tubes. 
6/22/17 MBB. 
When a microorganism is placed into a broth containing the appropriate 
nutrients to support growth, the microorganism flourishes and the broth 
becomes turbid. Turbidity is typically a simple visual indicator of microbial 
growth; this growth can be quantified by a UV-VIS spectrophotometer by 
measuring values absorbance or transmittance exhibited by the broth.
Test tubes containing growth broth, inoculum, test/unknown sample and 
standard curve ([S1] – [S5]), will be prepared and analyzed the same day. The 
test tubes are then placed into a circulating water bath for NMT 5 hours to 
reach a specified turbidity (i.e. absorbance). It is recommended, one or more 
QC tubes be used to perform an absorbance check at timed interval to assure 
the required absorbance is not exceeded; this activity may require the 
preparation of more than three QC tubes. After the specified absorbance is 

---