Ферментативные методы анализа, основаны на использовании хим р-ций с участием ферментов

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА , основаны на использовании хим. р-ций с участием ферментов. О содержании определяемого компонента судят либо по кол-ву конечного продукта ферментативной р-ции, либо, чаще, по начальной скорости процесса, положенного в основу методики определения (см. Кинетические методы анализа). Для наблюдения за скоростью ферментативной р-ции применяют обычно инструментальные методы, чаще других - люминесцентные, спектрофотометрич., электрохимические. Достоинства Ф. м. а.: высокая чувствительность, обусловленная активностью ферментов, природой индикаторных р-ций (с помощью к-рых определяют в-во) и способами детекции аналит. сигнала; высокая селективность и мягкие условия проведения анализа.
Определяемым компонентом в Ф. м. а. могут быть субстраты (в-ва, превращение к-рых катализирует фермент), сами ферменты, коферменты (в-ва, необходимые для осуществления каталитич. действия фермента) и эффекторы (соед., изменяющие каталитич. активность фермента - активаторы, ингибиторы). Среди коферментов - НАД и НАДН (соотв. никотинамидадениндинуклеотид и его восстановленная форма), НАДФ и НАДФН (соотв. никотинамидаденинди-нуклеотидфосфат и его восстановленная форма), АТФ (аде-нозинтрифосфат) и др.
Предел обнаружения, нижняя и верхняя границы определяемых содержаний компонентов зависят от кинетич. характеристик используемой индикаторной ферментативной р-ции и, прежде всего, каталитич. активности фермента.
Фермент катализирует р-ции, в к-рых участвуют, как правило, один или два субстрата. В односубстратной р-ции концентрация субстрата [S]₀ пропорциональна скорости процесса v₀ только при условии [S]₀ К_м, где К_м -константа Михаэлиса. Следовательно, верхняя граница определяемых содержаний лимитируется, как правило, величиной К_м. Предел обнаружения и ниж. граница анализируемых содержаний субстрата определяются обычно той величиной v₀, к-рая м. б. зафиксирована выбранным инструментальным методом. Чем меньше величина v₀ и чем выше каталитич. константа скорости k_кат и концентрация [E]₀ фермента, тем ниже предел обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний субстрата. Для двусубстратных р-ций при определении субстрата S₁ субстрат S₂ берется в насыщенных концентрациях и двусубстратная р-ция сводится к одно-субстратной.
В случае обратимого неконкурентного инги-бирования фермента ингибиторы I, взаимодействуя с ферментом, образуют каталитически неактивные комплексы EI. Для ингибиторов этого типа верхняя граница определяемых содержаний лимитируется величиной K_I =[EI] ; предел [E][I] обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний зависят также и от концентрации фермента. Такие же зависимости сохраняются и при определении обратимых активаторов ферментов.
В случае необратимого ингибирования ферментативных р-ций ниж. граница определяемых содержаний ингибитора зависит от времени ингибирования. Если значение константы скорости этого процесса k_ин невелико, относит. уменьшение активности фермента зависит от длительности процесса ингибирования. При достаточно больших k_ин временной зависимостью можно пренебречь, тогда относит. уменьшение активности фермента пропорционально концентрации ингибитора:  = n[I], где n - число молекул ингибитора, взаимодействующего с одной молекулой фермента.
В Ф.м. а. часто используют системы, состоящие из неск. сопряженных р-ций, катализируемых разл. ферментами. Так, напр., в случае системы из двух р-ций продукты первой ферментативной р-ции являются субстратами для второй ферментативной р-ции (индикаторной), что позволяет повысить чувствительность определения того или иного соед. и при необходимости изменить способ детекции. Так, напр., для определения глюкозы применяют р-цию ее окисления кислородом воздуха до глюконовой к-ты и H₂O₂, катализируемую глюкозооксидазой. Для контроля за скоростью процесса используют электрохим. методы, наблюдая за уменьшением кол-ва кислорода в р-ре с помощью О₂-чувствительного электрода Кларка или измеряя рН р-ра. Миним. содержание глюкозы, к-рое можно определять этими способами детекции, 0,01-0,03 мМ. Применяя биферментативные сопряженные р-ции для определения глюкозы, контролируют кол-во образовавшегося H₂O₂, напр. по р-ции окисления пероксидом водорода в присут. пероксидазы о-дианизидина (3,3'-диметок-сибензидина) с образованием окрашенного в-ва или люмино-ла с образованием люминесцирующего соединения. Спектрофотометрич. или люминесцентный методы контроля позволяют определять содержание глюкозы соотв. 2 мкМ и 20 нМ.
Как правило, чувствительность определения ферментов, коферментов и эффекторов выше, чем чувствительность определения субстратов. Напр., возможно определение 0,001 пМ содержания АТФ, 0,1 нМ ионов Hg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, 0,1 мкМ тиомочевины и меркаптоэтанола. Однако ряд субстратов определяют также при очень малых содержаниях, особенно при хеми- или биолюминесцентной (см. ниже) регистрации аналит. сигнала: 0,1 нМ H₂O₂, 0,01 нМ мочевины. Чувствительность определения мн. в-в Ф. м. а. часто более высока, чем чувствительность определения этих же компонентов любыми др. методами.
Высокая селективность Ф. м. а. обусловлена образованием фермент-субстратного комплекса в процессе каталитич. акта, требующим структурного соответствия активного центра фермента и субстрата. Поэтому большинство ферментов активно только в р-циях с субстратом одного определенного типа или с группой субстратов, имеющих общие структурные группы. Напр., фермент глюкозооксидаза катализирует окисление практически только одного вида глюкозы -  -глюкозу, к-рую можно определять без разделения сложной смеси моно-и олигосахаридов. В данном случае проявляется субстратная специфичность фермента.
Групповую специфичность можно наблюдать в случае действия альдегидоксидазы в р-циях превращения алифатич. альдегидов. Значительно менее селективны методы определения эффекторов, т. к. обычно имеется группа разл. соед., в той или иной степени меняющих каталитич. активность данного фермента. Однако селективность определения эффекторов м. б. и очень высокой. Так, очень малые кол-ва ртути (10 пМ) можно определять по ее ингибирующему действию на пероксидазу хрена на фоне тысячекратных кол-в Bi и Cd и значительно больших кол-в мн. неорг. и орг. в-в.