Ферментативный анализ субстратов представляет собой метод с использованием в качестве реактивов ферментов, которые способны в определенных условиях преобразовывать отдельные вещества (субстраты) с высокой специфичностью в продукты реакции. Субстраты, с которыми взаимодействуют ферменты, относятся к соединениям природного происхождения (например, сахара, органические кислоты и их соли, спирты и др.), участвующим в процессах метаболизма живой клетки. Таким образом, методологическую основу ферментативного анализа составляют природныебиохимические механизмы процесса обмена веществ, отдельные реакции которого воспроизводятся с большой точностью в искусственных условиях с целью количественного определения субстратов в монопродуктах или продуктах со сложным составом. Для проявления высокоспецифичных свойств ферментов и получения достоверного результата условия воспроизведения реакции максимально приближены к физиологическим условиям, существующим в живой клетке. В ходе ферментативной реакции должно быть достигнуто полное количественное преобразование исследуемого субстрата.
Специфичность, т.е. избирательность действия ферментов, обеспечивает достоверность результата ферментативной реакции, протекающей в искусственных условиях, поскольку он не зависит от влияния соединений, которые имеют сходное с анализируемым компонентом строение и входят с ним в матрицу исследуемой пробы.
Ход ферментативной реакции и ее ответ на внесение в систему субстрата контролируют с помощью физических методов путем измерения изменений качественного и количественного состава вспомогательных соединений или процессов.
В дегидрогеназных ферментных системах в качестве вспомогательных соединений используют окисленные или восстановленные формы коферментов NAD+/NADH, NADP+/NADPH. Эти коферменты участвуют в системе в качестве переносчиков водорода.
Количество окисленных коферментов NADH или NADPH стехиометрически соотносится с количеством анализируемого соединения (рис. 11.1).
Рис. 11.1. Механизм действия NADPH в дегидрогеназной ферментативной реакции
на примере определения D-молочной кислоты (D-ЛДГ – D-лактатдегидрогеназа)
Изменение формы коферментов контролируют спектрофотометрическим измерением оптической плотности – экстинкции – системы при 334, 340 или 365 нм. В интервале длин волн от 334 до 365 нм (оптимум 340) восстановленная форма NADH или NADPH проявляет максимальное поглощение (рис. 11.2).
Рис. 11.2. Спектры поглощения NADP (1) и NADPH (2)
Конечный результат ферментативной реакции рассчитывают на основании закона Ламберта–Бера из полученных значений оптической плотности восстановленной дегидрогеназной ферментной системы в начале и конце реакции.
В отдельных системах, например в определении сульфита, в качестве первичного фермента наряду с дегидрогеназами используют оксидазы. В ходе окислительной реакции происходит перенос водорода от субстрата к кислороду с образованием пероксида водорода. Последний может быть преобразован двумя различными способами с помощью фермента пероксидазы или с помощью фермента NADH-пероксидазы и NADH.
В комбинированных ферментных системах (КФС) определение субстратов также основано на использовании специфичного действия ферментов. Однако результат определения рассчитывают, исходя из интенсивности окрашивания системы, измерение которой проводят фотометрическим способом в видимой области спектра. В качестве вспомогательных соединений в КФС участвуют акцепторы электронов.
В ферментной системе в качестве суммарного определения пищевых волокон проводят предварительный гидролиз пробы с помощью гидролаз – α-амилазы, протеазы, глюкоамилазы. Продукты реакции после промежуточных стадий очистки и концентрирования определяют гравиметрическим способом.
Do'stlaringiz bilan baham: |
