Ферментные системы

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Ферментативные методы анализа основаны на использовании хим. реакций с участием ферментов. О содержании определяемого компонента судят либо по количеству конечного продукта ферментативной реакции, либо, чаще, по начальной скорости процесса, положенного в основу методики определения (см. кинетические методы анализа). Для наблюдения за скоростью ферментативной реакции применяют обычно инструментальные методы, чаще других — люминесцентные, спектрофотометрич., электрохимические. Достоинства Ф. м. а.: высокая чувствительность, обусловленная активностью ферментов, природой индикаторных реакций (с помощью которых определяют вещество) и способами детекции аналит. сигнала; высокая селективность и мягкие условия проведения анализа. Определяемым компонентом в Ф. м. а. могут быть субстраты (вещества, превращение которых катализирует фермент), сами ферменты, коферменты (вещества, необходимые для осуществления каталитич. действия фермента) и эффекторы (соед., изменяющие каталитич. активность фермента — активаторы, ингибиторы).
Среди коферментов — НАД и НАДН (соотв. никотинамидадениндинуклеотид и его восстановленная форма), НАДФ и НАДФН (соотв. никотинамидаденинди-нуклеотидфосфат и его восстановленная форма), АТФ (аде-нозинтрифосфат) и др. Предел обнаружения, нижняя и верхняя границы определяемых содержаний компонентов зависят от кинетич. характеристик используемой индикаторной ферментативной реакции и, прежде всего, каталитич. активности фермента. Фермент катализирует реакции, в которых участвуют, как правило, один или два субстрата. В односубстратной реакции концентрация субстрата [S]0 пропорциональна скорости процесса v0 только при условии [S]0Kм, где Kм -константа Михаэлиса. Следовательно, верхняя граница определяемых содержаний лимитируется, как правило, величиной Kм. Предел обнаружения и ниж. граница анализируемых содержаний субстрата определяются обычно той величиной v0, которая м. б. зафиксирована выбранным инструментальным методом. Чем меньше величина v0 и чем выше каталитич. константа скорости kкат и концентрация [E]0 фермента, тем ниже предел обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний субстрата. Для двусубстратных реакций при определении субстрата S1 субстрат S2 берется в насыщенных концентрациях и двусубстратная реакция сводится к одно-субстратной. В случае обратимого неконкурентного инги-бирования фермента ингибиторы I, взаимодействуя с ферментом, образуют каталитически неактивные комплексы EI. Для ингибиторов этого типа верхняя граница определяемых содержаний лимитируется величиной KI =[EI] ; предел [E][I] обнаружения и нижняя граница определяемых содержаний зависят также и от концентрации фермента. Такие же зависимости сохраняются и при определении обратимых активаторов ферментов. В случае необратимого ингибирования ферментативных реакций ниж. граница определяемых содержаний ингибитора зависит от времени ингибирования. Если значение константы скорости этого процесса kин невелико, относит. уменьшение активности фермента зависит от длительности процесса ингибирования.
При достаточно больших kин временной зависимостью можно пренебречь, тогда относит. уменьшение активности фермента пропорционально концентрации ингибитора: = n[I], где n — число молекул ингибитора, взаимодействующего с одной молекулой фермента. В Ф.м. а. часто используют системы, состоящие из неск. сопряженных реакций, катализируемых разл. ферментами. Так, напр., в случае системы из двух реакций продукты первой ферментативной реакции являются субстратами для второй ферментативной реакции (индикаторной), что позволяет повысить чувствительность определения того или иного соед. и при необходимости изменить способ детекции. Так, напр., для определения глюкозы применяют реакцию ее окисления кислородом воздуха до глюконовой кислоты и H2O2, катализируемую глюкозооксидазой. Для контроля за скоростью процесса используют электрохим. методы, наблюдая за уменьшением количества кислорода в растворе с помощью O2-чувствительного электрода Кларка или измеряя pH раствора. Миним. содержание глюкозы, которое можно определять этими способами детекции, 0,01–0,03 мМ. Применяя биферментативные сопряженные реакции для определения глюкозы, контролируют количество образовавшегося H2O2, напр. по реакции окисления пероксидом водорода в присутствии пероксидазы о-дианизидина (3,3'-диметок-сибензидина) с образованием окрашенного вещества или люмино-ла с образованием люминесцирующего соединения. Спектрофотометрич. или люминесцентный методы контроля позволяют определять содержание глюкозы соотв. 2 мкМ и 20 нМ. Как правило, чувствительность определения ферментов, коферментов и эффекторов выше, чем чувствительность определения субстратов. Например, возможно определение 0,001 пМ содержания АТФ, 0,1 нМ ионов Hg2+, Cu2+, Zn2+, 0,1 мкМ тиомочевины и меркаптоэтанола. Однако ряд субстратов определяют также при очень малых содержаниях, особенно при хеми- или биолюминесцентной (см. ниже) регистрации аналит. сигнала: 0,1 нМ H2O2, 0,01 нМ мочевины. Чувствительность определения мн. веществ Ф. м. а. часто более высока, чем чувствительность определения этих же компонентов любыми др. методами.
Высокая селективность Ф. м. а. обусловлена образованием фермент-субстратного комплекса в процессе каталитич. акта, требующим структурного соответствия активного центра фермента и субстрата. Поэтому большинство ферментов активно только в реакциях с субстратом одного определенного типа или с группой субстратов, имеющих общие структурные группы. Например, фермент глюкозооксидаза катализирует окисление практически только одного вида глюкозы — -глюкозу, которую можно определять без разделения сложной смеси моно- и олигосахаридов. В данном случае проявляется субстратная специфичность фермента. Групповую специфичность можно наблюдать в случае действия альдегидоксидазы в реакциях превращения алифатич. альдегидов. Значительно менее селективны методы определения эффекторов, т. к. обычно имеется группа разл. соед., в той или иной степени меняющих каталитич. активность данного фермента. Однако селективность определения эффекторов м. б. и очень высокой. Так, очень малые количества ртути (10 пМ) можно определять по ее ингибирующему действию на пероксидазу хрена на фоне тысячекратных количеств Bi и Cd и значительно больших количеств мн. неорг. и орг. веществ. Использование иммобилизованных ферментов. Недостатки Ф. м. а. обусловлены рядом особенностей ферментов: потерей функциональной активности и стабильности ферментов под воздействием разл. факторов; высокой стоимостью из-за невозможности многократного использования растворимых ферментов и трудности их выделения и очистки. Применение иммобилизованных ферментов расширило возможности Ф. м. а. Более высокая стабильность и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов позволили снизить стоимость анализов, повысить экспресс-ность, проводить хим. анализ в потоке и автоматизировать ферментативные методы. Впервые иммобилизованные ферменты в хим. анализе применили в сер. 60-х гг. 20 в.
Для обнаружения фосфорорг. пестицидов в воздухе использовали холинэстеразу, включенную в крахмальный гель, нанесенный на полиуретановую пластинку. С помощью глюкозооксидазы или лактатдегидрогеназы, включенных в полиакриламидный гель, определяли соотв. глюкозу или молочную кислоту. Помимо единичных иммобилизованных ферментов, в хим. анализе используют соиммобилизованные ферментные системы, позволяющие повышать чувствительность и селективность определения. При этом все чаще применяют иммобилизованные клетки микроорганизмов, содержащие естественный набор ферментов. Преимущество такой иммобилизации состоит в том, что исключаются стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов, увеличивается их стабильность. Иммобилизацию используют не только для ферментов, но и для субстратов, коферментов и эффекторов. Предложены разнообразные реакторы с иммобилизованными ферментами- колонки, трубки, полые нити. Для заполнения колонок применяют обычно ферменты, ковалентно связанные с аминированным стеклом, акриловыми полимерами, агарозой, сефарозой, найлоновым порошком, силикагелем и т. д. Один из лучших носителей для колоночных реакторов — ссфароза, активированная бромци-аном. На ней успешно иммобилизовали и полиферментные системы. Так, для определения 2–20 мкМ триптофана анализируемую смесь пропускали через колонку, содержащую соиммобилизованные на бромциан-сефаразе триптофаназу и лактатдегидрогеназу.
В трубчатых реакторах фермент ковалентно иммобилизуется на внутр. поверхности найлоновой трубки, длина которой варьирует от 1 до 3 м. С помощью таких реакторов, прокачивая через них анализируемый раствор, определяют, напр., в сыворотке крови мочевину, мочевую кислоту, аминокислоты, глюкозу, лактозу, мальтозу, пенициллин. Разработан метод включения ферментов внутрь полых волокон триацетатцеллюлозы в момент их формования. Фермент оказывается включенным во внутр. полость, куда могут проникать только низкомол. субстраты. Эти нити накручивают в виде катушек, заключают в стеклянную оболочку и через такой бобинный ферментный реактор пропускают анализируемую смесь, напр., при определении пенициллина, мочевины или глюкозы. Скорость пропускания потока смеси растворов, содержащих анализируемую пробу и реагенты, через реакторы устанавливают такой, что после прохождения через ферментный реактор реакция либо заканчивается (при анализе по конечному продукту), либо протекает до определенной глубины (скорость обычно определяют способом фиксированного времени).
Разновидности Ф. м. а. Среди наиб. чувствительных Ф. м. а. особое место занимают би о люминесцентные методы (см. люминесцентный анализ). Чаще других используют процессы, катализируемые ферментом люциферазой светляков. Система включает люциферин (формула 1, люциферин светляка), который в присутствии АТФ подвергается катализируемому люциферазой окислению кислородом с образованием люминесцирующего вещества. Высокий квантовый выход биолюминесценции, применение полиферментных сопряженных реакций позволяет определять некоторые соед. при концентрации 0,001–0,1 пМ. Один из важных Ф.м. а. — анализ с использованием ферментных электродов, которые сочетают высокую селективность биокатализа и совершенную технику электрохим. методов. В простейшем варианте расгворимый фермент помещают между двумя полупроницаемыми мембранами; одна отделяет раствор фермента от электродного датчика, другая — от анализируемого раствора. Однако чаще ферменты иммобилизуют, включая их в полимерные или гелевые пленки альбумина, желатины, агар-агара, коллагена, гидроксида Al или ковалентно присоединяя к поверхности стеклянных дисков, полупроницаемых мембран (целлюлозных, поликарбонатных). Пленки прикрепляют к поверхности электрода. Часто такую пленку (мембрану) готовят непосредственно на поверхности электрода. Субстрат диффундирует через слой, содержащий фермент, образуя электроактивное вещество, детектируемое при помощи потен-циометрич. или амперометрич. датчика.
Преимущества потенциометрич. детектирования — легкость изготовления ферментного электрода и более низкая его стоимость. Однако время отклика таких электродов весьма значительно. В качестве электрохим. датчиков при создании ферментных электродов этого типа часто используют стеклянный pH-электрод, NH+4-специфичный электрод, газовые электроды для CO2 и NH3. Потенциометрич. ферментные электроды были предложены для определения аминокислот, мочевины, глюкозы, пенициллина, нитрит- и нитрат-ионов; применяемые ферменты — оксидазы и декарбоксилазы аминокислот, уреаза, глюкозооксидаза, нитрит- и нитратредукта-зы и др. Амперометрич. ферментные электроды обычно применяют в случае ферментативных реакций, протекающих с выделением или потреблением O2 или H2O2. Используют при этом O2- или H2O2-чувствительные электроды. Амперометрич. детекторы отличаются от потенциометрических более широким диапазоном линейности. В амперометрич. ферментных датчиках применяют чаще всего ФАД(флавинадениндинуклеотид)-за-висимые оксидазы для определения глюкозы, холестерина, аминокислот. В ферментных электродах м. б. использованы не только одноферментные и полиферментные системы, но и клетки микроорганизмов ("бактериальные" электроды). Созданы ферментные электроды с ферментным реактором.
В таком электроде иммобилизованный (напр., на стеклянных шариках) фермент помещен в небольшой реактор, через который пропускают анализируемую пробу. Продукты реакции — электроактивные вещества, их детектируют с помощью проточных измерительных электродов. Ферментные электроды такого типа применяют для определения мочевины и аминокислот. Ферментные электроды представляют собой биосенсоры (см. сенсоры химические), которые позволяют быстро и селективно проводить определение целого ряда компонентов в сложных по составу объектах. На основе использования ферментов созданы разл. экспресс-тесты. Многие из них чрезвычайно просты. Например, тест-устройство для определения токсичных фосфорсодержащих пестицидов в продуктах питания представляет собой бумажную полоску, один конец которой пропитан раствором хро-могенного субстрата, а второй содержит иммобилизованную холинэстеразу.
При анализе концы полоски совмещают и обмакивают в воду, выжатый из фруктов или овощей сок и т. д. Появление окраски бумажки свидетельствует об отсутствии пестицидов в пробе. T. к. пестициды в больших, чем ПДК, количествах ингибируют холинэстеразу, то отсутствие окраски свидетельствует о превышении ПДК пестицидов. Аналогичные бумажные тесты предложены для определения глюкозы в моче и крови, ртути в воде и т. д. Широкое распространение получают иммунофер-ментные методы- разновидность иммунных методов анализа (радиоактивная или флуоресцентная метка заменяется ферментом). Их используют для определения иммуногло-булинов, гормонов, стероидов, лекарственных средств, пестицидов и др. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью и селективностью. Для повышения воспроизводимости, экспрессности и производительности в Ф. м. а. применяют автоматич. анализаторы разного типа (см. автоматизированный анализ). Катали-тич. реакции с участием растворимых и иммобилизованных ферментов, а также ферментных реакторов все чаще используют в проточно-инжекционном анализе. Ф. м. а. применяют в хим. анализе, по сравнению с др. методами, недостаточно. Из более чем 1800 полученных ферментов используют ок. 50; наиб. часто — глюкозооксида-зу, уреазу, уриказу, люциферазу, пероксидазу, алкогольдегидрогеназу, холинэстеразу, лактатдегидрогеназу, разл. аминоок-сидазы. Ф. м. а. позволяют определять селективно, а в отдельных случаях специфично такие биологически активные субстраты, как глюкоза, мочевина и мочевая кислота, разл. аминокислоты, липиды, холестерин, антибиотики, этанол, H2O2, NO−2 и NO−3 и мн. другие.
Разработаны чрезвычайно чувствительные методы определения мн. ферментов (перок-сидазы в крови, креатинфосфокиназы в крови при диагностике инсульта и инфаркта миокарда и др.) и коферментов (НАД, флавинмононуклеотид, АТФ и т. д.). Предложены методики чувствительного определения большого числа эффекторов ферментов (фосфорсодержащие пестициды, ионы Hg, Cu, Zn и др.). Чрезвычайно чувствительны и селективны методы определения некоторых ионов металлов (Zn, Cu) и анионов (CN−) на основе реактивации апоферментов. Цинк, напр., определяют практически специфически и в пикограммовых количествах по реактивации иммобилизованной пируватоксидазы, дезактивированной рядом комплексонов. Осн. области применения Ф. м. а. — клинич. медицина и биохимия. С помощью ферментов в крови, моче, тканях и др. биол. объектах определяют малые количества физиологически активных веществ, метаболитов, ферментов, мутагенов, канцерогенов, лек. препаратов. Высокочувствительный и специфический биолюминесцентный метод определения АТФ позволяет разрабатывать методики измерения количества клеток микроорганизмов, обнаружения микробных заражений, определения антибиотиков в биол. тканях и жидкостях по степени инги-бирования микробных клеток. Поскольку содержание АТФ пропорционально количеству клеток или биомассы, то эти методики чрезвычайно чувствительны и предел обнаружения может достигать 100 клеток. Ферментативные методы используют также в пищ. и фармакологич. промышленности, при контроле загрязнений окружающей среды. Так, напр., разработаны и применяются ферментативные методы определения фосфорсодержащих пестицидов, фенолов, аминов, ионов тяжелых металлов в природных и сточных водах. Лит.: Долманова И. Ф., Угарова Н.Н., "Ж. аналит. химии", 1980, т. 35, в. 8, с. 1597–1639; Кулис Ю.Ю., Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов, Вильнюс, 1981; Угарова H. H., Б ρ о в — ко Л. Ю., Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ, М., 1981; Bioana-lytical applications of enzymes, ed. by C. Suelter, в сб.: Methods of biochemical analyses, N. Y., 1992.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Ферментативный анализ представляет собой один из основных аналитических инструментов в международной и отечественной практике научных исследований, современного производственного и сертификационного контроля качества продуктов питания, пищевого сырья и биологических материалов.
Ферментативный анализ является составной частью энзимологии и аналитической химии и служит для специфического определения веществ с помощью высокоочищенных препаратов ферментов.
В основе ферментативного анализа лежат природные биохимические процессы обмена веществ, которые воспроизводятся in vitro: реакция фермента с субстратом, причем в качестве субстрата выступает анализируемое вещество пробы.
Основными преимуществами применения ферментативных методов в научных исследованиях, при разработке новых пищевых технологий и биотехнологических процессов, а также при анализе качества, идентификации и установления фальсификации продуктов питания и пищевого сырья являются:
1. Высокая специфичность и достоверность результатов. Высокоспецифичные ферментативные методы анализа дают, как правило, более достоверные результаты, чем неспецифические химические методы. Специфичность действия ферментов, основанная на комплементарное™ пространственной конфигурации активного центра и субстрата является гарантом достоверности и надежности ферментативного метода при исследовании отдельных соединений в многокомпонентных смесях, имеющих сложный состав и строение, таких, какими и являются пищевые продукты. При разработке ферментативных методов и подборе реагентов, в первую очередь, выбирают ферменты с наибольшей специфичностью действия, для которых подбираются оптимальные условия проведения анализа. Кроме того, при разработке методов ферментативного анализа отдельных компонентов продуктов питания обычно используют несколько ферментов, которые последовательно функционируют в данной системе.
2. Простые способы подготовки проб, которые исключают потерю исследуемых компонентов. Основная задача, которую необходимо выполнить при подготовке пробы, — по возможности наиболее полно сохранить для анализа исследуемый компонент без его количественной потери или изменения структуры. В некоторых случаях возможен прямой анализ пробы без ее предварительной подготовки (например, при абсолютной специфичности фермента к исследуемому веществу и отсутствии в пробе каких-либо мешающих факторов). Обычно же для ферментативного анализа используются простые и хорошо известные способы подготовки проб, такие как: разбавление, фильтрация (центрифугирование), нейтрализация (подкисление), экстракция, обезжиривание, осветление, обесцвечивание. Только в определенных случаях применяют специальные способы подготовки проб, например, при определении водонерастворимых соединений (холестерин, лецитин, крахмал), нестабильной L-аскорбиновой кислоты в твердых материалах и др.
3. Простая и быстрая процедура измерений, которая исключает использование дорогостоящего оборудования. В большинстве ферментативных определений используют фотометрические способы измерения результатов. Для этого все компоненты искусственной тестовой системы, например, буфер, коферменты, активаторы, вспомогательные ферменты и пробу смешивают в фотометрической кювете. После измерения начальной оптической плотности добавляют стартовый фермент, который инициирует реакцию. В конце реакции (через определенный промежуток времени) повторно измеряют оптическую плотность тестовой системы. Из разницы оптических плотностей в начале и в конце реакции по уравнению закона Ламберта — Бера рассчитывают концентрацию С (г/л) искомого соединения.
C =

[(E 2 - E 1) опыт - (E 2 - E 1) контроль]∙V∙M∙F

ε∙d∙v∙10000

где (E ₂ - E ₁) _опыт — разница конечной и начальной оптической плотности в кювете с пробой; (E ₂ - E ₁) _{контроль}— разница конечной и начальной оптической плотности в кювете без пробы; V — общий объем реакционной смеси, мл; М — молярная масса искомого соединения, г/моль; F — фактор разведения пробы; ε — молярный коэффициент экстинкции (например, кофермента НАДФ/НАД при λ = 340 нм, ε = 6,3 л/ммоль ∙ см); d — толщина кюветы, см; v — объем пробы, добавляемый в кювету, мл.
В большинстве ферментативных методов прямому фотометрическому контролю доступно измерение таких вспомогательных компонентов тестовой системы, как коферментов НАД⁺/ПАДН или НАДФ⁺/НАДФН. Количество восстановленных или окисленных коферментов прямопропорционально количеству искомого соединения. Система конечных значений с фотометрическим измерением результата настолько надежна, что
Таблица 8.5. Применение ферментативных методов для анализа различных компонентов пищевых продуктов [А. Ю. Колесное. Ферментативный анализ в пищевой промышленности, 1996. № 11]

Группа продуктов	Анализируемые компоненты
Детское питание, диетические продукты	Сахароза, D-глкжоза, D-фруктоза, лактоза, мальтоза, крахмал, L-аскорбиновая кислота, лимонная кислота, D-, L-молочные кислоты, D-сорбит, ксилит, лецитин, холин
Пиво, вино, игристые вина	D-глюкоза, D-фруктоза, сахароза, глюкозный сироп, этанол, глицерин, D-сорбит, сульфит, нитраты, L-, D-молочные кислоты, D-глкжоновая кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота, L-аскорбиновая кислота
Хлеб, хлебобулочные изделия, шоколад, мороженое и конд. изделия	Сахароза, D-глкжоза, D-фруктоза, лактоза, мальтоза, крахмал, этанол, глицерин, D-сорбит, ксилит, холестерин, лецитин
Яйца и яичные продукты	Янтарная кислота, L- молочная кислота, D-3-гидроксимасляная кислота, холестерин
Соки, фруктовые продукты, безалкогольные напитки	Сахароза, D-глкжоза, D-фруктоза, лимонная кислота, D-изолимонная кислота, L-аскорбиновая кислота, D-, L-молочные кислоты, этанол, уксусная кислота, глюкозный сироп, щавелевая кислота, глицерин, D-, L-яблочные кислоты, муравьиная кислота, D-глюконовая кислота, D-сорбит, нитраты
Мясо и мясные продукты	Сахароза, лактоза, D-глюкоза, D-галактоза, крахмал, лимонная кислота, уксусная кислота, D-глюконовая кислота, L-глутаминовая кислота, D-, L-молочные кислоты, муравьиная кислота, глицерин, аммиак (мочевина), креатин/ креатинин, пирофосфаты, холестерин
Молоко и молочные продукты	Лактоза, D-глюкоза, D-галактоза, D-фруктоза, крахмал, сахароза, лимонная кислота, уксусная кислота, L-яблочная кислота, янтарная кислота, L-глутаминовая кислота, D-, L-молочные кислоты, этанол, ацетальдегид, триглицериды, мочевина, нитраты
Пищеконцентраты (например, супы)	Сахар и сахаристые изделия
Креатин, L-глутаминовая кислота, сахароза, крахмал	Сахароза, D-глюкоза, D-фруктоза, раффиноза, муравьиная кислота, лимонная кислота, D-, L-молочные кислоты, D-сорбит, этанол

служит в качестве стандарта для оценки других методик. Для проведения ферментативного анализа используется стандартное оборудование, которое имеется практически в любой производственной лаборатории: спектрофотометры или фотометры с интервалом измерений от 325 до 800 нм; кюветы для фотометрических измерений, мерные пипетки и дозаторы, весы, центрифуга, рН-метр, водяной термостат, фильтры и т. п.
4. Высокая чувствительность метода и хорошая воспроизводимость результатов. Высокая чувствительность позволяет использовать ферментативные методы для определения следовых количеств веществ. Например, в продуктах питания могут быть определены следующие концентрации компонентов (г/л): этанол — 0,001; ацетоальдегид — 0,001; лимонная кислота — 0,002; глицерин — 0,001; D-глюкоза — 0,002; D-сорбит — 0,001; лактоза — 0,005; нитраты — 0,001.
Кроме вышеперечисленных достоинств ферментативных методов анализа можно назвать и универсальность применения, высокую надежность и устойчивость к мешающим факторам, низкие затраты на проведение анализа (время, оборудование, расходуемые материалы), а также использование безопасных реактивов.
Области применения ферментативного анализа на практике многообразны. Это и производственный контроль, и контроль качества готовой продукции, а также контроль сырья, анализ состава пищевого продукта с целью установления их свойств и соответствия законодательным нормам, оценка гигиенического статуса, идентификация и установление фальсификации.
В табл. 8.5 приведены некоторые группы продуктов питания, а также их компоненты, для анализа которых разработаны специфические ферментативные методы.
По словам одного из основоположников ферментативного анализа Г. Бергмана: " Ферментативный анализ, как принцип, свободен от недостатков и ошибок, т. к. он представляет систему для измерений, которую успешно использует живая клетка уже в течение миллионов лет".

Список литературы

1. Долманова И. Ф., Угарова Н.Н., "Ж. аналит. химии", 1980, т. 35, в. 8, с. 1597-1639
2. Кулис Ю.Ю., Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов, Вильнюс, 1981
3. Угарова H. H., Бровко Л. Ю., Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ, M., 1981
4. Bioana-lytical applications of enzymes, ed. by C. Suelter, всб.: Methods of biochemical analyses, N. Y., 1992. И. Ф. Долманова.
5. А.М.Егоров, А.П.Осипов и др. Теория и практика иммуноферментного анализа, М., Высш.шк., 1991