Фибриллы внеклеточного матрикса состоят из белков коллагена (до 30% массы всех белков организма), фибронектина и эластина, а также, в случае кости, из кристаллов фосфата кальция

3.6.4. Генетические основы перепрограммирования соматических клеток в стволовые клетки. В тканевой инженерии, наряду с МСК, широкое применение получили создаваемые на основе соматических клеток индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК - Induced Pluripotent Stem Cell). В этом процессе непосредственное участие принимают транскрипционные факторы и гены, в числе которых хорошо изученные, например:

• 
  * Oct3/4 — играет ключевую роль в раннем эмбриональном развитии поддерживая плюрипотентность стволовых клеток; нарушении работы этого гена на стадии бластоцисты ингибирует формирование эмбриобласта; у взрослых организмов ген Oct3/4, за исключением некоторых стволовых популяций и опухолевых клеток, репрессирован;
  
• 
  Sox2 — фактор связывается с малой бороздкой ДНК; активен в раннем эмбриогенезе, поддерживает популяцию клеток в СК состоянии; мутация гена приводит к врождённым порокам развития (отсутствие одного или обоих глаз);
  
• 
  c-Myc - протоонкоген, ДНК-связывающий фактор транскрипции, отвечает за регуляцию около 15% генов; влияет на работу модифицирующей структуру хроматина гистон-ацетилтрансферазы, регулируя тем самым экспрессию генов; участвует процессах дифференциации, клеточного роста и апоптоза;
  
• 
  Klf-4 — фактор активации/супрессии генов; экспрессируется в дифференцирующихся клетках эпителия и при поражениях сосудов;
  
• 
  Lin28 — маркер активности стволовых клеток, селективно усиливает трансляцию мРНК, регулирует синтез важного в эмбриональном развитии и в формировании мышц. инсулиноподобного фактора роста (IGF2); ген активен в тканях эмбриона, стволовых клетках и мышцах и в миокарде взрослого организма;
  
• 
  NANOG — определяет плюрипотентность, ингибирование этого гена запускает дифференцировки стволовых клеток; определяет возможность стволовых клеток по неограниченному росту в лаборатории и в организме.
  

Механизм перепрограммирования соматических клеток в ИПСК путем активации экспрессии факторов транскрипции показал эффективность процесса «факторами Яманаки» на уровне 0,02%, а время образования колоний — 16 дней Использование аденовирусов, позволяет избежать модификацию генома клеток, снижало эффективность процесса еще на порядок. Впоследствии эффективность увеличили почти до 100%, а процесс образования колоний ускорили до 7 дней (Yoach Rais et. al., 2013).
Для ИПСК характерна иммунологическая нейтральность, а также возможность их неограниченного производства без участия ЭСК (эмбриональные стволовые клетки) в результате перепрограммирования зрелых дифференцированных клеток организма. Основными особенностями ИПСК является то, что:

• 
  их получают без использования эмбрионов, что снимает множество этических ограничений;
  
• 
  можно получить от самого пациента, что позволяет обеспечить полную иммуносовместимость;
  
• 
  наличие факторов перепрограммирования экспрессирующиеся в течение короткого времени без интеграции соответствующего гена в геном снижает риск возникновения онкогенных мутаций;
  
• 
  генетически идентичны донору и могут быть использованы в качестве in vitro модели для изучения индивидуальных молекулярных механизмов патологии и для персонализированного подбора лекарств.
  
• 
  можно получать клетки заданного типа путем направленной дифференцировки и при необходимости корректировать неисправные гены;
  
• 
  могут быть использованы для введения пациенту с целью восстановления функций ткани.
  

В 2008 году показали, что ЭСК можно получать из зародышей без ущерба для его развития, если на стадии бластоцисты (4-8 клеток) из эмбриона выделить один из бластомеров. Вместе с тем, этические проблемы стимулировали создание стволовых клеток, на основе ИПСК путем «перепрограммирования» генома дифференцированных зрелых клеток в состояние плюрипотентности. Ш. Яманака с сотр. (2008) трансформировали фибробласты кожи человека генами факторов Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc. Отмечено, через несколько дней после трансформации фибробластов, клетки начали менять свою форму, образуя морфологически идентичные колониям ЭСК клетки. При этом клетки прекратили синтез характерных для фибробластов белков (виментин), но начали синтез характерных для стволовых клеток (Sox2, NANOG, REX1, FGF4 и другие) факторов роста и дифференциации. Анализ уровня деметилирования генома этих клеток показал, что генетичекая активность индуцированных СК перестроилась на «эмбриональный» тип. Кроме того, был отмечен рост активности гена теломеразы.
Регуляция процессов дифференцировки связана с функциями гистонового кода и процесса метилирование ДНК, что оказывает непосредственное влияние на экспрессию генов в нужных участках хромосомы. При этом регуляция активности генов осуществляется большими белковыми комплексами в состав которых входят молекулы коротких РНК, выполняющие роль зондов для определения необходимого участка ДНК. Подобное эпигенетическое регулирование активности генов, без изменения ДНК, оказывает непосредственное влияние на выбор клеткой путей развития. Последовательное культивирование соматических клеток в среде разного особого состава, постепенно трансформирует их в ИПСК. Например, такое культивирование фибробластов в течение 25 дней, с частотой ~2*10^-4, приводит к появлению колоний ИПСК, способных давать начало клеткам всех трёх зародышевых листков. Тотипотентность таких ИПСК доказали по их способности формировать опухоли (тератом) при их инъекции мышам с генетически слабым иммунитетом (стандартный «тест на стволовую клетку»).

Рис. 1.16. Схема получения и изображение эмбриоидных телец ИПСК. Клетки взрослого организма получают путем биопсии, после чего их трансфецируют набором факторов Яманаки и высаживают на фидер. Перепрограммирование клеток и формирование эмбриодных телец требует 16 дней.

Изучение механизма перепрограммирования показало особую роль в этом процессе факторов Oct3/4 и Sox2, которые активно работают в плюрипотентых стволовых клеток, но не активны в соматических. Эти факторы активируют «стволовые и эмбриональные» гены в клетке, заставляя отвечающие за специализацию гены снизить свою активность. В зрелой клетке эти факторы не индуцируют трансформацию клеток, возможно, из-за метилирования промоторов соответствующих генов и модификаций гистонов. Предполагают, что c-Myc и Klf4 модифицируют структуру хроматина, открывая доступ к промоторам генов. По крайней мере, фактор Klf4 способен регулировать активность ацетилтрансферазы гистонов (присоединяет ацетильную группу к «хвостам» гистона), и, тем самым регулировать экспрессию генов.

После «перепрограммирования», гены c-Myc и Klf4 снижают свою активность настолько, что лишь около 20% мышей, полученных из рекомбинированных этими генами стволовых клеток, страдали онкологическими болезнями, что указывает на повторную активацию этих генов. То есть, основная часть дедифференцированных стволовых клеток, для поддержания ИПСК в «стволовом» состоянии, не требует активности генов c-Myc и Klf4. То есть то, что наблюдается в постнатальном периоде развития организма. В дальнейшем Яманака и его группа показали, что перепрограммирование соматических клеток в ИПСК может происходить без гена c-Myc в случае, если клеткам требуется в два раза больше времени, - вместо 7 дней, 14. Несмотря на более низкую эффективность трансформации, в полученные таким образом стволовые клетки мышей были меньше подвержены образованию опухолей.
В случае, если вместо факторов c-Myc и Klf-4 используют продукты генов Sox2, Oct4, NANOG и LIN28 было показано, что для перепрограммирования абсолютно необходима активность генов Oct4 и Sox2, тогда как NANOG и LIN28 не столь существенна (падает эффективность и замедляется процесс).
На ход перепрограммирования, подобно белкам-индукторам плюрипотентности, существенное влияние оказывает состав питательной среды, где культивируются клетки. Например, введение вальпроевой кислоты (C₈H₁₆O₂ – 2-пропил-пентановая кислота, М.м = 144,211; лекарство от эпилепсии) способно заменить функции онкогенных факторов (Sox2, Oct4 и Klf-4) при индукции ИПСК на основе фибробластов человека (Danwei Huangfu, et al., 2008). Введение этой кислоты в среду, где выращивали фибробласты человека, вместе с белками Sox2, Oct4 и Klf-4 увеличивало эффективность перепрограммирования в 10³ раз, - в стволовые превращалось около 1% клеток. При исключении из среды фактора Klf-4, эффективность процесса падала до 0,001 – 0,01%. Этот эксперимент показал, что вальпроевая кислота позволяет исключить Klf-4 и, тем самым, понизить потенциальную возможность злокачественного перерождения клеток.
Для перепрограммирования в стволовые клетки наряду с фибробластами можно использовать клетки рогового слоя и волос (кератиноциты). В экспериментах с факторами Oct4, Sox2, Klf-4 и c-Myc показали стократное увеличение эффективности перепрограммирования при сокращении длительности эксперимента вдвое, - 6–7 день после трансфекции появлялись первые колонии ИПСК, практически неотличимые от эмбриональных СК. (T. Aasen et al., 2008).
В настоящее время пытаются заменить генетические факторы перепрограммирования клеток на низкомолекулярные химические препараты. Например, Динг (институт Скриппса) с соавторами показали способность двух гетероциклических соединений осуществлять перепрограммирование без интеграции гена Sox2. Подобно вальпроевой кислоте, вещество BIX является ингибитором гистон-ацетилтрансферазы и ДНК-метилтрансферазы — ферментов-регуляторов структуры хроматина и активности генов. Вещество BayK8644 не меня активность генов, выступало в качестве агониста кальциевых каналов мембраны клетки, что позволяло существенно увеличить выход соматических клеток.
Таким образом, исследования последних лет направлены на то, чтобы клеточное перепрограммирование осуществлялось без интеграции в геном клетки ретровирусов. Кроме того, для перепрограммирования кроме фибробластов стали использовать и другие типы клеток (кератиноциты).
В перспективе, стволовые клетки (СК) способны создавать практически любой полноценный орган, готовый для трансплантации донору. Число стволовых клеток во взрослом организме тысячи раз меньше, чем в эмбрионах. Этическая проблема, связанная с извлечением СК из эмбрионов человека, способствовала поиску путей по «перепрограммированию» соматических клеток в состояние, характерное для СК «стволового». Ожидается, что использование стволовых клеток позволит на порядки повысить эффективность медицины за счет повышения эффективности регенерации органов, их трансплантации без отторжения и т.д.