Green Chemistry Extractions of Carotenoids from Daucus carota L.—Supercritical Carbon Dioxide and Enzyme-Assisted Methods

4. Enzyme-Assisted Extractions (EAE)
As stated above, the solvent-based extractions of bioactive compounds from natural sources often
su
ffer from low extraction yields, require long extraction times and the final product may contain
trace amounts of organic solvents that have a huge negative impact on the product quality. The EAE
was shown to be e
ffective, environmentally friendly and a selective method for bioactive compound
extraction. Enzymes can be perfectly matched catalysts to assist in the extraction of various bioactive
compounds from natural origins. The inherent ability possessed by enzymes to catalyze reactions
with high specificity, to degrade or disrupt cell walls and membranes and to operate under mild
processing conditions in aqueous solutions makes the EAE an interesting alternative for the more
e
fficient extraction of phytochemicals from biological matrices [
110
]. EAE has a better profile in
terms of the disruption of the cell walls, while compared to the microwave- and ultrasound-assisted
extraction because a higher e
fficiency the process is achieved with a lower energy expenditure [
46
].
Recently, enzyme-assisted technology has been widely used to extract bioactive compounds from many
plants. The addition of specific enzymes during the extraction improves the recovery of a compound of
interest by breaking the cell wall and hydrolyzing the structural polysaccharides since some compounds
are retained in the polysaccharide-lignin network by hydrogen or hydrophobic bonding, and are hardly
accessible with a solvent in a routine extraction process [
111
]. The successful application of enzymes
for the extraction of the carotenoids, vanillin, polysaccharide, oil, and polyphenols, among others,
was shown many years ago and is still actively investigated [
112
–
115
].
Among enzymes that could be applied in the EAE approach various enzymes, especially highly
complex large polymers such as proteases, pectinase, cellulase, tannase, or carbohydrases could be
mentioned [
116
]. In 2010 Wang et al. [
117
] presented the extraction method of phenolic compounds from
Palmaria palmata (red algae, Rhodophyta) with the use of proteases and carbohydrases, whereas Fernández,
Vega and Aspé [
118
] used pectinase, cellulase, and tannase enzymes for the extraction of phenolic
compounds from the skins and seeds of grape with pectinase being the most e
ffective for the extraction
e
fficiency of phenolic compounds [
117
,
118
]. Other, well-studied, bioactive compounds are volatile
compounds such as those found in garlic. EAE with the use of cellulase, pectinase, protease, individually,
as well as a commercial mixture of enzymes—Viscozyme
®
L (consisting of cellulase, hemicellulase,
arabinase, xylanase, amylase, and β-glucanase, St. Louis, MO, USA) might be used for the pretreatment
of garlic. Enzyme pretreatment of garlic resulted in a higher yield of oil (0.5%), compared to the control
(0.28%), without any meaningful di
fferences in physicochemical properties of the volatile oil [
119
].
The water uses a solvent instead of organic chemicals in EAE for the extraction of bioactive compounds
makes this technique eco-friendly and perfectly fulfills the “green chemistry” postulates [
111
].
4.1. EAE of Carotenoids
There are numerous reports on the extraction of carotenoids from vegetable sources, with
the preferred source being tomato peels and carrots. But other plant matrices are also under
investigation. Nath et al. [
23
] presented the application of three carbohydrases enzymes: Viscozyme
®
L, pectinase and cellulase for the liquefaction ability in terms of recovery of total carotenoids, total
phenolics, total flavonoids and ascorbic acid from the red capsicum extract. Obtained extracts were
planned to be used as natural colorants and functional ingredients in foods. The authors studied the
performance of the above-mentioned enzymes and their utility for carotenoid extraction. Viscozyme
®
L
and pectinase were observed to cause significantly higher liquefaction that was proved by the increased
extract yield (80%–87%). Also, the improvement in percentage yield of aqueous extract was determined
with increasing dosage of all enzymes. To conclude, EAE significantly improved the recovery of total

---

Molecules 2019, 24, 4339
12 of 20
carotenoids in the aqueous extract [
23
]. The authors also paid attention to the optimization of the
most appropriate extraction conditions to carry out said EAE. Analyses performed by Wang et al. [
46
]
showed that pH, extraction time, extraction temperature, and enzyme concentration all have significant
e
ffects on the enzymatic carotenoid extraction method from Cordyceps militaris (fungi, Ascomycota) by
evaluating the antioxidant activities of the extract [
46
]. The scientific data also address the undesirable
oxidation of carotenoids during standard solvent-based extraction and present the EAE as the better
alternative for carotenoids high yield extraction. Strati et al. [
120
] demonstrated an increased recovery
of carotenoids from tomato processing waste with the use of enzymes with pectinolytic and cellulolytic
activities. They proposed EAE as a pre-treatment procedure before the solvent extraction which caused
an increase in the extraction yields of analytes from plant sources [
120
]. Also, the drying step of the
extraction could be omitted while EAE is implemented in the experimental platform. The isolation of
carotenoids together with other biologically relevant compounds was optimized, too.
Mai et al. [
121
] presented research where the main intent was to investigate the performance of a
combination of several enzymes: cellulase, pectinase, protease, and α-amylase in the extraction of oil rich
in carotenoids from garlic [
121
]. The acquired data showed that the total carotenoid content increases
linearly with the oil recovery, while EAE- based method was enacted. Nevertheless, they also pointed out
that the high required ratio of the enzyme limits the economic potential. Therefore, further improvements
should be made such as the optimization of combined extraction approaches where enzymatic
degradation is performed together with the microwave or ultrasonic extraction [
121
].
4.2. EAE of Carotenoids from Daucus Carota L.
Carrot tissue EAE was presented in the literature some time ago. The data revealed that treatment
with a combination of pectinase, cellulase, cellobiase, and pectin lyase increased the lycopene yield by
approx. 50%. Enzyme treatments lead to changes in the microstructure and extractability, while some
of the carotene complexes and interactions were broken. The EAE carrot sample pretreatment resulted
in increased carotene extractability. Moreover, scientists, especially those wishing to follow the “green
chemistry” expectations, tried to re-use the pomace remains after the production of the carrot juice. It is
commonly used as feed or fertilizer, but it could also be a valuable source of carotenes. Thus, it is of
utmost importance to present novel, “green chemistry” methods aimed at recovering the carotene-rich
functional food ingredient from carrot pomace. During the extraction fine grinding of the suspension
of carrot pomace in water using a colloid mill and the subjection of the pomace to enzymic hydrolysis,
homogenization and concentration should be carried out. For the enzymic hydrolysis, Pectinex
®
Ultra
SP-L (PU; pectinase with hemicellulolytic activities, St. Louis, MO, USA) could be combined with
either Cellubrix
®
L or Cytolase CL (CE and CY, respectively; cellulolytic activity, St. Louis, MO, USA).
The data showed that combinations of PU and CY was a more e
ffective strategy than each of the
enzyme alone and a 1:1 ratio was the most e
ffective [
122
]. The co-extraction of carotenoids with other
relevant compounds (such as pectins) could also be mentioned. This approach could add value to the
additive for functional food formulation. In the recent study performed by Encalada et al. [
123
] the
combination of EAE with ultrasound extraction was examined. It was determined that this combined
extraction leads to an increased yield of extraction of pectins, α- and β-carotens, among others and
hemicellulase was the enzyme that produced the highest increase in the yield of extraction [
123
].
In recent years, many researchers have focused on the extraction of analyte from carrots and other
vegetables by using enzymatic treatments. Usually, manual methods of carotenoids extraction could
cause undesirable flavor and color changes during the cell wall disintegration to release carotenoids.
EAE has been found to prevent these negative changes during carotenoid extraction, the reason being
that the extracted carotenoids by enzymes are still bound to proteins, so they provide stability to the
color and structure of unsaturated pigment [
25
]. The utilization of enzymes mixture generated from
microorganisms could also reduce the processing time for carotenoids extraction [
25
]. Around 50% of
carotenoids can be lost during the extraction process, thus the use of enzymatic application prior to
solvent extraction can e
fficiently reduce the extraction losses [
124
]. Applying enzymatic pre-treatments

---

Molecules 2019, 24, 4339
13 of 20
to the vegetable matrix can increase the cell wall permeability, enhancing the leaching process of
carotenoids. Thus, a positive correlation between carotenoid extraction and enzyme pretreatment was
found [
125
]. Holanda [
126
] obtained two times more carotenoid extraction after enzymatic hydrolysis
of shrimp waste as compared to solvent extraction using oil. During solvent extraction, the carotenoid
recovery increased to 17% to 31% after using alcalase pretreatment. Several studies have found that
complex vegetable matrices could be hydrolyzed by using a combination of di
fferent enzymes [
25
] The
application of raw enzymes has several benefits compared to the commercial enzymes due to their lower
cost and shorter processing time in carotenoid extraction [
6
,
25
]. Water is also an important parameter
to consider during EAE of carotenoids from vegetable matrices, as optimum water concentration is
necessary for enzymatic hydrolysis of the cell wall matrix [
124
]. Agitation during enzymatic extraction
facilitates the enzyme di
ffusion from the liquid phase into the vegetable matrix (solid phase). This rapid
enzymatic adsorption can accelerate the lysis of the cell wall, leading to an increase in the extraction
yield. Therefore, agitation plays an important role during the enzymatic extraction of carotenoids [
61
].
Industrially, many microorganisms are employed for the generation of various cellulolytic
enzymes [
127
]. Aspergillus niger is one of the most important multi-enzymes producer microorganism
to generate pectinases, hemi-cellulases, cellulases, glucoamylases, showing enzyme activities of
7.62, 15.86, 0.99 and 13.37 U mg
−1
of protein respectively [
15
]. Cellulase and pectinase enzymes
are commonly used during pretreatment before solvent extraction. Cellulase usually acts on the
cellulose that is present below the first half layer of the cell wall in plants [
14
]. Cellulases can be
produced from the reaction of cellulolytic microorganisms to domestic and agro-industrial waste.
Currently, Aspergillus niger, Trichoderma longibrachiatum, and Saccharomyces cerevisiae are commonly used
for cellulose production [
128
]. Pectin is also a major constituent of the cell walls in plants. Pectin is a
polysaccharide composed of long chains of galacturonic acid with 1.4-α-links [
129
]. Pectinase enzymes
can break down pectin compounds to release carotenoids [
14
]. The combination of di
fferent enzymes
such as methylesterases and depolymerases is required to degrade galacturonate units in pectin
compounds 38. The e
ffect of EAE on carotenoids from Gac fruit (Momordica cochinchinensis Spreng.)
was studied by Kha et al. [
47
]. The results showed that the highest extraction of the carotenoids content,
specially β-carotene was achieved by using enzyme concentration at 0.1% (w
/w) for pretreatment Kha
et al. [
47
]. Strati et al. [
120
] also evaluated the use of cellulase and pectinase enzymes to assist the
high-pressure extraction of carotenoids from tomato waste. It was concluded that the extraction yields
of total carotenoid and lycopene were enhanced after the use of enzyme pretreatment before extraction.