I bob. Oqsil strukturalarini va uning turlari

2.2.Molekulyar va molekulalararo kontaktlarni farqlash muammosi
Protein kristalli tuzilishini hal qilish uchun bosqichma-bosqich muammoni – faqat intensivlik ma'lumotlarini to'g'ridan-to'g'ri o'lchash qobiliyatini eksperimental yoki hisoblash vositalaridan foydalangan holda engish kerak. Kontaktni bashorat qilish, strukturaviy eritmaning hisoblash yo'li sifatida molekulyar almashtirish (MR) uchun eng mos keladi (1-rasm). MRda noma'lum maqsadli tuzilmaning kamida bir qismiga yaqin bo'lgan "qidiruv modeli" odatda ketma-ket aylanish va tarjima bosqichlari orqali nosimmetrik birlikda joylashgan. Keyinchalik bu joylashtirilgan struktura dastlabki elektron zichlik xaritalarini hisoblash imkonini beruvchi taxminiy faza ma'lumotlari manbai sifatida ishlatilishi mumkin. Biroq, MRni alohida ko'rib chiqishdan oldin, barcha bosqichma-bosqich yondashuvlar uchun protein maqsadining domen tuzilishini har tomonlama tushunish qiymatini takrorlash kerak.
Maqsad va ma'lum protein tuzilmalari yoki oilalari (domenlari) o'rtasidagi tan olingan evolyutsion munosabatlar eksperimental tuzilma yechimini
osonlashtiradigan xususiyatlar mavjudligini qimmatli ravishda bashorat qilishi mumkin. Masalan, metallni bog'lash, asosni bog'lash yoki kofaktor bilan bog'lash joylari har bir tabiiy ligandlarni yoki ularning sun'iy analoglarini, foydali anomal tarqalish xususiyatlariga va/yoki yuqori massaga ega atomlarni o'z ichiga olishi mumkin. Bunday hollarda bitta kristalli yoki ko'p kristalli diffraktsiya ma'lumotlari anomal tarqalish va / yoki izomorf almashtirish yondashuvlari bilan hal qilish uchun javob beradi (Dauter, 2002 Hendrickson, 2014). Hatto uzoq gomologiyalarni aniqlashning mashhur usullariga kiradi HHpred (Söding va boshqalar. , 2005 https://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred), Phyre (Kelli va boshqalar. , 2015 http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/
phyre2/) va FFA S-3 D (Xu va boshqalar. , 2014 http://ffas.godziklab.org). Maqsadli va ma'lum tuzilmalar o'rtasidagi yashirin evolyutsion munosabatlarni tanib olishning bunday usullari kontaktni bashorat qilishdan ikki jihatdan foyda keltiradi.
Aminokislotalarni ajratish mumkin ion almashinadigan xromatografiya keyin ularni aniqlashni osonlashtirish uchun derivatsiya qilingan. Odatda, aminokislotalar hosil bo'ladi, so'ngra eritiladi teskari faza HPLC.
Ion almashinadigan xromatografiyaning namunasi MTRK tomonidan sulfatlangan polistirolni matritsa sifatida ishlatib, aminokislotalarni kislota eritmasiga qo'shib va ​​doimiy ravishda ortib boruvchi buferdan o'tkaziladi. pH ustun orqali. Aminokislotalar pH mos keladigan darajaga yetganda elutatsiya qilinadi izoelektrik nuqtalar. Aminokislotalarni ajratib bo'lgach, ularning ranglarini hosil qiluvchi hosil qiluvchi reaktiv qo'shib ularning tegishli miqdori aniqlanadi. Agar aminokislotalarning miqdori 10 nmoldan oshsa, ninhidrin buning uchun ishlatilishi mumkin; u prolin bilan reaksiyaga kirishganda sariq rang, boshqa aminokislotalar bilan esa jonli binafsha rang beradi. Aminokislota kontsentratsiyasi hosil bo'lgan eritmaning yutilishiga mutanosibdir. Juda oz miqdorda, soat 22.00 gacha, lyuminestsent hosilalar, masalan, reagentlar yordamida hosil bo'lishi mumkin orto-ftaldegid (OPA) yoki floresamin.
Ustundan oldingi derivatizatsiya ultrabinafsha nurlari bilan aniqlanadigan lotin hosil qilish uchun Edman reaktividan foydalanishi mumkin. Kattaroq sezgirlikka lyuminestsent lotin hosil qiluvchi reaktiv yordamida erishiladi. Hosil bo'lgan aminokislotalar, odatda C8 yoki C18 yordamida teskari fazali xromatografiyaga uchraydi. kremniy kolonu va optimallashtirilgan elution gradient.¹ Elitatsiya qiluvchi aminokislotalar ultrabinafsha yoki lyuminestsentsiya detektori yordamida aniqlanadi va
namunadagi har bir aminokislotani miqdorini aniqlash uchun hosil bo'lgan standartlar bilan taqqoslaganda eng yuqori joylar.