2.1.5 Piroglutamik kislotaning N-terminal qoldig'ining parchalanishi
Ba'zi peptidlarda Edmanning N-uchi sekvensiyasiga xalaqit beradigan piroglutamik kislota qoldig'i borligi aniqlandi. Uning parchalanishi uchun bloklangan N-terminal aminokislota qoldig'i bilan 1 nmol tozalangan peptid vakuumli kontsentratorda quritilgan va 50 µl E1 eritmasida eritilgan. Namunaga 1 mu piroglutamat aminopeptidaza fermenti (EC: 3.4.19.3) qo'shildi. Namunalar 75 ° C da 4 soat davomida inkubatsiya qilindi, shundan so'ng blokirovka qilingan peptid Vydac C18 ustunida RP-HPLC tomonidan 1 ml/min oqim tezligida B2 eritmasining 60 daqiqali chiziqli konsentratsiyali gradienti (0-60%) yordamida ajratildi.
2.1.6 N-uchli aminokislotalar ketma-ketligini aniqlash
Tozalangan peptid komponentlarining N-terminal ketma-ketligini aniqlash ishlab chiqaruvchining usuli bo'yicha PPSQ-33A avtomatik sekvenserida Edmanning bosqichma-bosqich degradatsiyasi usuli bilan amalga oshirildi.
2.1.7 Affin xromatografiyasi
Hujayra lizatasi K1 boshlang'ich eritmasida 3 ml TALON Superflow Metal Affinity Resin ustuniga 1 ml/min oqim tezligida qo'llanildi. Kimerik oqsilni izolyatsiyalash sorbent ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. Nonspesifik sorbsiya ehtimolini istisno qilish uchun ustun K2 eritmasi bilan yuvilgan. Bog'langan fraktsiya imidazolning yuqori konsentratsiyasi bo'lgan K3 elyusiya eritmasi yordamida olingan. Aniqlash 280 nm da eluatning optik yutilishi orqali amalga oshirildi. Ish tugagandan so'ng, qatron ustuni 20 mM 2-(N-morfolino) etansulfonik kislota (MES) va suv eritmasi bilan yuviladi.
Do'stlaringiz bilan baham: |
