Mundarija kirish I – bob. Biotexnologiyaning rivojlanishi

III.2. Gen injenerligining fermentlari
Gen injenerligida rekombinant DNKlarni konstruksiyalashda ishlatiladigan fermentlar quyidagi guruhlarga bo'linadilar:

• 
  DNK fragmentini olish uchun ishlatiladigan fermentlar (restriktazalar);
  
• 
  DNK matritsasida DNKni (polimerazalar) va RNKni (qaytar transkriptazalar) sintezlovchi fermentlar;
  
• 
  DNK fragmentlarini birlashtiruvchi fermentlar (ligazalar);
  
• 
  DNK fragmenti uchlari strukturasini o'zgartiruvchi fermentlar.
  

Restriktazalar (restriksiyalovchi endonukleazalar) — DNK molekulasida ma’lum bir nukleotidiar ketma-ketligi (restriksiya saytlari) ni tanib, ularga ≪hujum qiluvchi≫ fennentlardir.
Restriksiya va modifikatsiya tizimlari bakteriyalarda keng tarqalgan bo‘lib, ular rezident DNKni begona nukleotidlaming kirishidan himoya qiladi. 1968-yil Mezelson va Yuanlar metillanmagan DNKni parchalovchi restriktazani ajratib olganlar. 1970-yil esa Smit va Vilkoks Haemophilus influenzae dan DNKning aniq bir ketma-ketligini parchalovchi birinchi restriktaza (Hind III)ni ajratib olganlar. Hozirgacha 3500 dan ko‘proq restriktazalami substrat spetsifikligi aniqlangan boiib, ulardan 238 tasi nukletid ketma ketligining unikal strukturasini taniydilar (prototiplar).
DNKning bir xil uchastkasini taniydigan restriktazalar izoshizomerlar guruhini tashkil qilib, bir-birlaridan ba’zi bir xossalari bilan farq qiladilar. Jumladan, 2 zanjirli DNKni har xil parchalaydilar. Hozirgacha aniqlangan restriktazalarning yarmidan ko‘prog‘i, 4, 6, 8 nukleotid ketma-ketlikni taniydilar.
Bakteriyalaming barcha restriksion endonukleazalari o‘ziga xos, qisqa DNK ketma-ketligini taniydi va ular bilan boglanadi. Bu jarayonda DNK molekulasi tanish saytida kesiladi. Bakteriya shtammi restriksion faollikka ega bolishi bilan birga DNKni metillash xususiyatiga ham ega bolish i mumkin archa restriktazalar DNKning qo‘sh spiralida ma’lum bir ketma-ketlikni taniydi, lekin 1-sinf restriktazalari DNK molekulasining ixtiyoriy nuqtasini kesadi, 2- va 3-sinf restriktazalari esa tanish saytining ichidagi qat’iy bir nuqtalami parchalaydi.
1 - va 3-sinfdagi fermentlar murakkab subbirlikdagi tuzilishga ega bo’lib, 2-sinfdagi, ya’ni metillovchi va ATFga bogiiq endonukleazali faollikka egadir.
2-sinf fermentlari 2 ta alohida oqsillardan: restriksiyalovchi endonukleaza va modifikatsiyalovchi metilazalardan tashkil topgan. Shuning uchun gen injeneriyasida asosan 2-sinf fermentlari ishlatiladi. Bular uchun kofaktor sifatida magniy ionlari zarurdir.
Qaytar transkriptaza m-RWKni DNKning komplementar zanjiriga transkripsiyalash uchun ishlatiladi. Genomi bir zanjirli RNK molekulalaridan iborat bo‘lgan retroviruslar o‘rganilganda, retrovirusning hujayraning ichida sodir bo‘ladigan rivojlanish jarayonida xo'jayin hujayra xromosomasiga ikki zanjirli DNK
ko'rinishida o ‘z genomining integratsiya bosqichini bosib o ‘tishi aniqlangan. 1964-yil Temin RNK-matritsada komplementar DNKni sintezlovchi ferment borligini aniqlagan. Ushbu RNKga bog‘liq DNK-polimeraza qaytar transkriptaza yoki revertaza deb nomlangan.
Qaytar transkriptaza reaksiyasi RNK faollikka ega bo‘lgan kuchli ingibitorlardan foydalangan holda maxsus sharoitlarda olib boriladi. Bunda RNK molekulalarining to ‘liq hajmli DNK-nusxalari olinadi. Praymer sifatida poli (A)-tutuvchi m-RNK ning qaytar transkripsiyasida oligo (aT), З'-poli (A) ucliiga ega bo‘lmagan RNK molekulalari uchun esa kimyoviy sintezlangan oligonukleotidlar ishlatiladi. m-RNKda DNKning komplementar zanjiri sintezlangandan va RNK buzilgandan keyingina DNKning ikki zanjiri sintezlanadi.
Matritsa sifatida k-DNKning birinchi zanjiri bolishi mumkin. Bu reaksiya revertaza singari E.Coli ning DNK-polimerazasi yordamida katalizlanishi mumkin. Sintez tugagandan so‘ng k-DNKning 1- va 2-zanjirlari shpilka tuguni bilan kovalent bog'langan holda qoladi. Bu tugun endonukleaza SI bilan parchalanadi. Hosil bo‘lgan ikki zanjirli DNKni klonlanayotgan vektorlarga kiritish, DNKning gibrid molekulalari tarkibida ko‘paytirish va keying tadqiqotlarda ishlatish mumkin boladi. 1-rasmda 2 zanjirli DNKnusxasining sintez boiishi ko‘rsatilgan.

1-rasm. RNK molekulasining ikki zanjirli DNK-nusxasini sintezlash
chizmasi.