O’simlik to’qimalaridan dnk ni ajratib olish

Mavzu: Biologik to‘qimalardan genom DNKsini ajratish usullari
Mashg’ulotning maqsadi: O’simlik to’qimalaridan turli metodlar yordamida genom DNK ajratish o’rgatiladi.
Kerakli asbob-uskunalar: Laminar-boks, vakuum asosida DNKni quritish asbobi (kontsentrator), vorteks, tsentrifuga, suv hammomi, termostat, gorizontal blokli gel-elektroforez jihozlari, dozatorlar, probirkalar, rezina qo’lqoplari.
Amaliy mashg’ulotni bajarishda rioya qilinadigan texnika xavfsizlik qoidalari: Mashg’ulotlarni bajaruvchi hamma talabalar texnika xavfsizligi bo’yicha yo’riqnoma talablari bilan tanishtirilgan bo’lishlari lozim. Shuningdek talaba o’qituvchi yoki laborantning ruxsatisiz turli moddalarni, asbob-uskunalarni o’zboshimchalik bilan ishlatishi mumkin emas.
Ishning bajarilishi.
O’simlik to’qimalaridan genom DNKlarini ajratish uchun yangi yig’ib olingan yoki muzlatilgan holatdagi barg namunalaridan foydalaniladi. Genom DNK ajratishning quyidagi asosiy usullari mavjud.
1) STAV detergentini qo’llagan holda Murray va Thompson usuli asosida o’simlik namunalaridan genom DNK ajratish:

1. 
   Namunalardan 100 mg. barg to’qimalari sterillangan farfor idishlarga solinib suyultirilgan azot yordamida gomogenat (kukun) holatiga kelgunga qadar maydalanadi.
   
2. 
   Gomogenat ustiga 65^oS gacha qizdirilgan 2xSTAB buferidan 4 ml solinadi va sterilangan shpatel bilan aralashtiriladi.
   
3. 
   Gomogen suspenziyadan 900 mkl olinib, 2 ml hajmli Eppendorf steril probirkalarga solib chiqiladi va yaxshilab aralashtiriladi.
   
4. 
   Gomogenat solingan probirkalar 60 daqiqa davomida 65°C haraoratli suvli hammomda har 5 daqiqa aralashtirib turgan holda inkubatsiya qilinadi.
   
5. 
   Shundan so’ng, har bir probirkaga teng (900 mkl) hajmda 24:1 nisbatdagi xloroformG’izoamil spirti aralashmasi solib chiqiladi.
   
6. 
   Probirkalar qopqoqlari mustahkam yopildi va vorteks uskunasi yordamida yaxshilab aralashtiriladi. So’ngra, probirkalar 5 daqiqa muddatga (10000 martaG’daq. tezligida) tsentrifugalanadi.
   
7. 
   Probirkalar yuzasida hosil bo’lgan suyuqlik qismi 2 ml hajmli yangi steril probirkalarga o’tkaziladi.
   
8. 
   Har bir probikaga 0,1 hajm miqdorda 65°C gacha qizdirilgan 10xSTAVG’NaCl buferi solinib 5 daqiqa termomikserda yaxshilab aralashtiriladi.
   
9. 
   Yana bir bor har bir probirkaga teng hajmda (900 mkl) 24:1 nisbatli xloroformG’izoamil spirti aralashmasi solib chiqildi va yaxshilab aralashtiriladi.
   
10. 
    So’ngra, probalar 10000 martaG’daq. tezligida 5 daqiqa tsentrifugalanadi.
    
11. 
    Probirkalarning tepa qismida hosil bo’lgan suyuqlik qismi yana 2 ml steril holatidagi yangi probirkalarga o’tkaziladi.
    
12. 
    Har bir probaga 1:1 hajmda STAB pretsipitatsiya buferidan solinib yaxshilab aralashtiriladi va 65°C gacha qizdirilgan suvli hammomda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilinadi.
    
13. 
    Inkubatsiyadan so’ng, 14000 martaG’daq. tezligida 15 daqiqa tsentrifugalanadi hamda suvli qism to’kib tashlanadi.
    
14. 
    DNK cho’kmasiga esa 500 mkl miqdorida yuqori tuzli TE buferidan solib chiqiladi.
    
15. 
    Probalar cho’kma erib ketgunga qadar yaxshilab aralashtiriladi va aralashma ustiga 0,6 hajm izopropil spirtidan qo’shilib 1-2 daqiqa aralashtiriladi.
    
16. 
    So’ngra, 15 daqiqa (14000 martaG’daq. tezligida) tsentrifugalandi va suyuqlik qismi to’kib tashlanadi.
    
17. 
    DNK cho’kmasini 2 marta 1 ml 70% li etil spirtida chayib olinadi. Har safar chayilganda 5 daqiqa (14000 martaG’daq. tezligida) tsentrifugalanadi va DNK cho’ktirib olinadi.
    
18. 
    Cho’ktirilgan DNK vakuumli kontsentrator uskunasida 45°C haroratda quritiladi va 200 mkl TE buferida eritiladi.