Pmcid: pmc4186376 pmid

Kalit so'zlar: antioksidant, yallig'lanishga qarshi, shaftoli, himoya ta'siri
O'tish:
Kirish
Meva va sabzavotlarni noto'g'ri iste'mol qilish saraton, yurak-qon tomir kasalliklari, insult va insulin qarshiligi kabi bir qator kasalliklar uchun xavf omilidir. ^{( 1 , 2 )} Meva va sabzavotlarni muntazam iste'mol qilish qizilo'ngach, oshqozon, oshqozon osti bezi, siydik pufagi va bachadon bo'yni saratonining oldini olish bilan bog'liq; Meva va sabzavotlar bilan boyitilgan dietalar saratonning aksariyat turlarining 20 foizini oldini oladi. ^( 3 ) Kohort tadqiqotlarining meta-tahlili shuni ko'rsatdiki, kuniga iste'mol qilingan mevaning har bir qo'shimcha qismi uchun yurak-qon tomir kasalliklari va qon tomirlarini rivojlanish xavfi sezilarli darajada kamaygan, bu himoya ta'sirini ko'rsatadi. ^( 4 )Shuningdek, mevalarni dietali iste'mol qilish Altsgeymer kasalligi xavfini kamaytirish va yosh bilan kognitiv pasayish bilan bog'liq bo'lishi mumkinligi xabar qilingan. ^( 5 ) Ba'zi meva va sabzavotlar, ayniqsa, kasallik xavfi yuqori bo'lganlar orasida Altsgeymer kasalligining boshlanishini kechiktirishda muhim rol o'ynashi mumkin. ^( 6 )
Erkin radikallar va tegishli turlar (birgalikda reaktiv turlar deb ataladi) aerob metabolizm natijasida doimo hujayralar tomonidan ishlab chiqariladi. Reaktiv turlarning ortiqcha ishlab chiqarilishi oksidlovchi stressga olib kelishi mumkin, bu esa lipidlar, oqsillar va DNKning oksidlovchi shikastlanishiga olib keladi. Natijada, saraton, yurak-qon tomir kasalliklari va neyrodegenerativ holatlar kabi oksidlovchi stress bilan bog'liq kasalliklarni rivojlanish xavfi oshishi mumkin. ^( 7 )Reaktiv turlar bilan kurashish uchun hujayralar ushbu turlarni to'g'ri tozalash/detoksifikatsiya qilish uchun fermentativ va ferment bo'lmagan antioksidantlarning etarli hovuzini saqlashi kerak. Enzimatik bo'lmagan antioksidantlar orasida dietadan olingan ekzogen birikmalar erkin radikallarni zararsizlantirishda va o'z navbatida kasallikning oldini olishda muhim rol o'ynaydi. Meva va sabzavotlardan olingan fenolik birikmalar va karotinoidlar oksidlanishdan himoyalanishda muhim rol o'ynaydi. ^( 8 ) Odatda oksidlovchi stress bilan bog'liq bo'lgan kasalliklarni rivojlanish xavfini kamaytirish ushbu birikmalar bilan boyitilgan dietalar bilan bog'liq. ^( 3 )
Shaftolining turli navlari ( Prunus persicaL. Batsch) butun dunyoda juda ko'p iste'mol qilinadi. Shaftoli ko'plab g'arbiy mamlakatlarda eng muhim tosh mevali ekin bo'lib, Evropa, Shimoliy va Janubiy Amerikada turli xil iqlim sharoitlari va tuproq turlarida etishtiriladi. Shaftoli turli madaniyatlarda, asosan, ularning ta'mi va ozuqaviy qiymati tufayli qadrlanadi; ammo, shaftoli iste'molining inson salomatligi uchun potentsial foydalari bo'yicha tadqiqotlar hali ham boshlanmayapti. Shaftoli yuqorida aytib o'tilganidek, muhim biologik ta'sir ko'rsatadigan va kasallikning oldini olish bilan bog'liq bo'lgan penol birikmalari, karotenoidlar va tokoferollar kabi ko'plab ikkilamchi metabolitlarni taqdim etadi. Shunga qaramay, Farmakologik tadqiqotlarning aksariyati biologik faollikka qaratilgan bo'lib, bu birikmalarning fraktsiyalari va/yoki izolyatsiya qilingan shakllarini boyitadi va faqat bir nechta tadqiqotlar shaftoli va uning hosilalari funktsional oziq-ovqat sifatidagi potentsialini baholadi. So'nggi paytlarda butun dunyo bo'ylab iste'molchilar sog'liqni saqlash yoki kasalliklarning oldini olishda aniq rol o'ynaydigan oziq-ovqat mahsulotlarini tobora ko'proq qidirmoqdalar, shuning uchun ishlab chiqaruvchilar qishloq xo'jaligi mahsulotlarining yangi navlarini yaratishda bunday afzalliklarni hisobga olishmoqda. Mevalarga kelsak, hozirgi tendentsiya boshqa ozuqaviy va lazzat bilan bog'liq xususiyatlarga ta'sir qilmasdan, potentsial antioksidant, anti-glisemik, yallig'lanishga qarshi va o'smalarga qarshi ta'sirga ega bo'lgan o'simlik endogen birikmalarining tarkibini yoki mavjudligini kuchaytirishdir. butun dunyo bo'ylab iste'molchilar sog'lomlashtirish yoki kasalliklarning oldini olishda aniq rol o'ynaydigan oziq-ovqat mahsulotlarini tobora ko'proq qidirmoqdalar, shuning uchun ishlab chiqaruvchilar qishloq xo'jaligi mahsulotlarining yangi navlarini yaratishda bunday afzalliklarni hisobga olishdi. Mevalarga kelsak, hozirgi tendentsiya boshqa ozuqaviy va lazzat bilan bog'liq xususiyatlarga ta'sir qilmasdan, potentsial antioksidant, anti-glisemik, yallig'lanishga qarshi va o'smalarga qarshi ta'sirga ega bo'lgan o'simlik endogen birikmalarining tarkibini yoki mavjudligini kuchaytirishdir. butun dunyo bo'ylab iste'molchilar sog'lomlashtirish yoki kasalliklarning oldini olishda aniq rol o'ynaydigan oziq-ovqat mahsulotlarini tobora ko'proq qidirmoqdalar, shuning uchun ishlab chiqaruvchilar qishloq xo'jaligi mahsulotlarining yangi navlarini yaratishda bunday afzalliklarni hisobga olishdi. Mevalarga kelsak, hozirgi tendentsiya boshqa ozuqaviy va lazzat bilan bog'liq xususiyatlarga ta'sir qilmasdan, potentsial antioksidant, anti-glisemik, yallig'lanishga qarshi va o'smalarga qarshi ta'sirga ega bo'lgan o'simlik endogen birikmalarining tarkibini yoki mavjudligini kuchaytirishdir.
Braziliyada mo''tadil iqlim sharoitida yangi mevalarni, shuningdek, sharbat va sirop bilan konservalangan pulpa kabi hosilalarini iste'mol qilish uchun Makiel navining shaftolilari ishlab chiqilgan. Biroq, shaftolining ushbu tijorat turining sog'liq uchun potentsial foydalari va ayniqsa, yangi meva va sirop bilan konservalangan pulpa kabi shaftolidan sotiladigan asosiy mahsulotlarning biologik faolligi haqida kam narsa ma'lum. Shu munosabat bilan, ushbu tadqiqot Embrapa (Braziliya qishloq xo'jaligi tadqiqot korporatsiyasi) tomonidan ishlab chiqilgan Maciel navli shaftolilarning sitoprotektiv, antioksidant va yallig'lanishga qarshi xususiyatlarini in vitro va ex vivo yordamida aniqlash uchun o'tkazildi.tahlillar. Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, yangi shaftoli pulpalari (FPP) va qobig'i antioksidant, glikatsiyaga qarshi va yallig'lanishga qarshi xususiyatlarni namoyish etadi va bu xususiyatlarning ba'zilari siropga asoslangan shaftoli pulpa konservalarida (PPP) ham mavjud.
O'tish:
Materiallar va usullar
Kimyoviy moddalar
Katalaza (CAT, EC 1.11.1.6), superoksid dismutaza (SOD, EC 1.15.1.1), tiobarbiturik kislota (TBA), temir sulfat (FeSO ₄ ), vodorod periks (H ₂ O ₂ ) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ELISA mikroplastinkalari Greiner Bio-One (Monroe, LA) va ELISA TMB spektrofotometrik aniqlash to'plami BD Biosciences (San-Diego, CA) kompaniyasidan edi. O'simta nekrozi omili alfa (TNF-a) quyon poliklonal antikor, Interleykin-1 beta (IL-1b) quyon poliklonal antikor va peroksidaza bilan bog'langan anti-quyon immunoglobulini Cell Signaling (Danvers, MA). Tozalangan rekombinant TNF-a oqsili Abcamdan (Kembrij, Buyuk Britaniya) va IL-1b BDdan edi. MilliQ bilan tozalangan H ₂O eritmalar tayyorlash uchun ishlatilgan. Laktat dehidrogenaza (LDH) faollik to'plami Labtestdan (Lagoa Santa, Minas-Jerais, Braziliya) olingan. Quyidagi HPLC standartlari Sigma (Sent-Luis, MO) dan sotib olindi: b-kriptoksantin (tozalik>97%), b-karotin (tozalik>93%), a-karotin (tozalik>95%), zeaksantin (tozalik>). 95%). Lutein (tozaligi> 95%) Indofine (Hillsborough, NJ) dan sotib olingan. HPLC darajasidagi erituvchilar, jumladan metil- tert -butil va metanol Scientific Hexis kompaniyasidan (Jundiai, San-Paulu, Braziliya) sotib olingan. Shaftoli namunalari Embrapa Clima Temperado tomonidan taqdim etilgan.
Hayvonlar
Voyaga etgan erkak Wistar kalamushlari (60 kunlik; vazni 280-300 g) naslchilik koloniyamizdan olingan. Ular standart tijorat oziq-ovqatlari (CR1 laboratoriya chow, Nuvilab, Kuritiba, Parana, Braziliya) va suvga bepul kirish huquqiga ega bo'lgan to'rtta hayvonlardan iborat guruhlarga qafasga solindi va 12 soatlik yorug'lik-qorong'u tsiklda (7:00-19:00) saqlandi. ) harorat bilan boshqariladigan koloniya xonasida (21 ° C). Barcha eksperimental protseduralar Milliy Sog'liqni saqlash institutlari ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi. ^( 9 ) Bizning tadqiqot protokolimiz Universidade Federal do Rio Grande do Sulning Hayvonlar tajribasi bo'yicha axloqiy qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan. Ushbu tadqiqot uchun o'nta sog'lom hayvonlar ishlatilgan. Fenton reaktsiyasi (FeSO) tomonidan gidroksil vositachiligidagi zararning optimal induksiyasini aniqlash uchun uchta hayvon bilan tajriba sinovi o'tkazildi.₄ va H ₂ O ₂ ).
Shaftoli namunalarini tayyorlash
Maciel navi Embrapa Clima Temperado tomonidan boshqariladigan duragaylash orqali ishlab chiqilgan. Urug'lar kamerada 4 ± 1 ° C haroratda laminatlangan va keyin ko'chatlar ko'chatlar tajriba maydoniga ko'chirish uchun issiqxonada etishtirilgan. Mevalar shu daladan olingan (Pelotas, Rio Grande-du-Sul, Braziliya, joylashuv koordinatalari: –31°30'57,44'', –52°33'11,52''). Meva yig'ib olingandan so'ng darhol qobig'i va pulpalari ajratilgan va -20 ° C da muzlatilgan (chuqurlar olib tashlangan va bo'shatilgan). Mevalar, shuningdek, sanoatda qayta ishlash orqali sirop asosidagi konservalarni tayyorlash uchun ishlatilgan, bu yirik tijorat konservalangan shaftoli konservalarini ishlab chiqarishda qo'llaniladigan protsedura. Qisqacha aytganda, mevalar yarmiga bo'linadi va chuqurlar burama bilan ajratiladi. Mevalar yugurish yo'lakchasida sodali suv (NaOH 50%) dushga asoslangan peeling protsedurasidan o'tkaziladi va sodani olib tashlash uchun darhol yuviladi. Pulpalar qutilarga solinadi va issiq saxaroza asosidagi sirop (suv: saxaroza = 80:20) qo'shiladi. Konservalar yopiladi, sterilizatsiya qilinadi va keyin sovutiladi. Konservalarda umumiy og'irligi 820 g (siropdagi pulpa) va 485 g drenajlangan og'irlik bor edi. To'rt oydan keyin qutilar ochildi va pulpa va sirop ajratildi va liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Yangi pulpa va qobig'ining namunalari ham bir vaqtning o'zida liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Liyofilizatsiya L108 Liotop uskunasida (Liobras, San-Paulu, Braziliya) Embrapa Clima Temperado tajriba blokida amalga oshirildi. Liyofillangan namunalar -20 ° C da saqlanadi, tajriba paytida ultra toza suvda eritiladi va keyin santrifüjlanadi (4000 × Pulpalar qutilarga solinadi va issiq saxaroza asosidagi sirop (suv: saxaroza = 80:20) qo'shiladi. Konservalar yopiladi, sterilizatsiya qilinadi va keyin sovutiladi. Konservalarda umumiy og'irligi 820 g (siropdagi pulpa) va 485 g drenajlangan og'irlik bor edi. To'rt oydan keyin qutilar ochildi va pulpa va sirop ajratildi va liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Yangi pulpa va qobig'ining namunalari ham bir vaqtning o'zida liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Liyofilizatsiya L108 Liotop uskunasida (Liobras, San-Paulu, Braziliya) Embrapa Clima Temperado tajriba blokida amalga oshirildi. Liyofillangan namunalar -20 ° C da saqlanadi, tajriba paytida ultra toza suvda eritiladi va keyin santrifüjlanadi (4000 × Pulpalar qutilarga solinadi va issiq saxaroza asosidagi sirop (suv: saxaroza = 80:20) qo'shiladi. Konservalar yopiladi, sterilizatsiya qilinadi va keyin sovutiladi. Konservalarda umumiy og'irligi 820 g (siropdagi pulpa) va 485 g drenajlangan og'irlik bor edi. To'rt oydan keyin qutilar ochildi va pulpa va sirop ajratildi va liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Yangi pulpa va qobig'ining namunalari ham bir vaqtning o'zida liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Liyofilizatsiya L108 Liotop uskunasida (Liobras, San-Paulu, Braziliya) Embrapa Clima Temperado tajriba blokida amalga oshirildi. Liyofillangan namunalar -20 ° C da saqlanadi, tajriba paytida ultra toza suvda eritiladi va keyin santrifüjlanadi (4000 × sterilizatsiya qilinadi va keyin sovutiladi. Konservalarda umumiy og'irligi 820 g (siropdagi pulpa) va 485 g drenajlangan og'irlik bor edi. To'rt oydan keyin qutilar ochildi va pulpa va sirop ajratildi va liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Yangi pulpa va qobig'ining namunalari ham bir vaqtning o'zida liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Liyofilizatsiya L108 Liotop uskunasida (Liobras, San-Paulu, Braziliya) Embrapa Clima Temperado tajriba blokida amalga oshirildi. Liyofillangan namunalar -20 ° C da saqlanadi, tajriba paytida ultra toza suvda eritiladi va keyin santrifüjlanadi (4000 × sterilizatsiya qilinadi va keyin sovutiladi. Konservalarda umumiy og'irligi 820 g (siropdagi pulpa) va 485 g drenajlangan og'irlik bor edi. To'rt oydan keyin qutilar ochildi va pulpa va sirop ajratildi va liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Yangi pulpa va qobig'ining namunalari ham bir vaqtning o'zida liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Liyofilizatsiya L108 Liotop uskunasida (Liobras, San-Paulu, Braziliya) Embrapa Clima Temperado tajriba blokida amalga oshirildi. Liyofillangan namunalar -20 ° C da saqlanadi, tajriba paytida ultra toza suvda eritiladi va keyin santrifüjlanadi (4000 × Yangi pulpa va qobig'ining namunalari ham bir vaqtning o'zida liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Liyofilizatsiya L108 Liotop uskunasida (Liobras, San-Paulu, Braziliya) Embrapa Clima Temperado tajriba blokida amalga oshirildi. Liyofillangan namunalar -20 ° C da saqlanadi, tajriba paytida ultra toza suvda eritiladi va keyin santrifüjlanadi (4000 × Yangi pulpa va qobig'ining namunalari ham bir vaqtning o'zida liyofilizatsiyaga duchor bo'ldi. Liyofilizatsiya L108 Liotop uskunasida (Liobras, San-Paulu, Braziliya) Embrapa Clima Temperado tajriba blokida amalga oshirildi. Liyofillangan namunalar -20 ° C da saqlanadi, tajriba paytida ultra toza suvda eritiladi va keyin santrifüjlanadi (4000 × g 3 min) qo'pol zarralarni cho'ktirish uchun (har doim yorug'lik va haroratdan himoyalangan). Supernatant suspenziyasi to'plangan va tajribalar uchun ishlatilgan. Har bir tahlil uchun turli xil shaftoli olingan namunalar eritmasidan turli xil ketma-ket suyultirishlar olingan va barcha tajribalarda ishlatilgan. Ushbu suyultirilgan namunalarning alikvotlari HPLC tahlilidan o'tkazildi.
To'qimalarning bo'laklarini tayyorlash
Hayvonlar boshi kesilgan holda o'ldirilgan. Buyrak, jigar va miya po'stlog'i tezda olib tashlandi va 40 ± 5 mg og'irlikdagi bo'laklarga bo'linadi (1-rasm). 1). To'qimalarning bo'laklari to'qimalarni maydalagich (Redding, Kaliforniya) bilan tayyorlangan va darhol muz ustiga qo'yilgan. To'qimalar oldindan isitiladigan Kreb's Ringer Hepes (KRH) kislorod bilan muvozanatlangan eritmasida (2,5 mM Hepes, 118 mM NaCl, 2,85 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,5 mM KH 2, PO 4M _4M 4M 4M ₄ m ) _saqlandi . -gidroksibutirat va 4,0 mM glyukoza, pH 7,4) 1 soat davomida. Namunalar chayqaladigan suv hammomida (60 tebranish / min) 2 ml KRH o'z ichiga olgan probirkalarda 30 daqiqa davomida 95% O ₂ /5% CO ₂ ostida 37 ° C da yuvildi . KRH muolajalarni o'z ichiga olgan inkubatsiya muhiti bilan almashtirildi va 1 soat davomida inkubatsiya qilindi. Ushbu inkubatsiyadan keyin FeSO ₄ (1 mM) va H ₂O ₂ (100 mM) qo'shildi va Fenton reaktsiyasini yaratish uchun 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. ^( 10 ) Inkubatsiyadan so'ng muhit yig'ildi, 3000 × g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi va sitotoksiklik va yallig'lanish parametrlarini baholash uchun foydalanildi (pastga qarang). To'qimalarning bo'laklari 50 mM fosfat tamponida (PB, KH ₂ PO ₄ va K ₂ HPO ₄ pH 7,4) bir hil holga keltirildi va 6000 × g da 5 daqiqa davomida 4 ° C da santrifüj qilindi. Inkubatsiya muhiti va homogenatlarning oqsil miqdori ma'lumotlarni normallashtirish uchun Bredford usuli bilan aniqlandi. ^( 11 )



1-rasm
Grafik abstrakt
Umumiy reaktiv antioksidant potentsial (TRAP tahlili)
Jami reaktiv antioksidant potentsial (TRAP) fermentativ bo'lmagan antioksidant salohiyat ko'rsatkichi sifatida ishlatilgan. Ushbu tahlil AAPH [2,2azobis (2-amidinopropan)] tomonidan ishlab chiqarilgan peroksil radikallarini ma'lum bir namunada mavjud bo'lgan antioksidantlar tomonidan o'chirishga asoslangan. ^( 12 )Qisqacha aytganda, doimiy tezlikda peroksil radikallarini hosil qiluvchi kimyoviy tizim (AAPH o'z ichiga olgan bufer) lyuminestsent reaktivga (luminol) ulanadi, u oksidlanishiga mutanosib ravishda fotonlarni chiqaradi. Reaksiya luminolni AAPH ni o'z ichiga olgan 0,1 M glitsin buferiga (pH 8,6) yuborish orqali boshlandi, bu esa barqaror luminesans emissiyasiga olib keldi. Keyin bu reaktsiya tizimiga teng miqdordagi namunalar qo'shiladi va bu qo'shilishdan keyingi momentdagi luminesans emissiyasi (t = 0) qayd etiladi. Ushbu boshlang'ich emissiya namuna qo'shilgandan so'ng birinchi daqiqada AAPH tomonidan erkin radikallar ishlab chiqarishni aks ettiradi va namunaning endogen oksidlovchi holati bilan bog'liq. Kuluçkadan so'ng, AAPH ning termal parchalanishi doimiy tezlikda luminesans hosil qiladi ("tizim"), va qo'shilgan namunada erkin radikallarni tozalash vositalarining mavjudligi fermentativ bo'lmagan antioksidantlar tarkibiga ko'ra bu tezlikni kamaytiradi. Namuna qo'shilishi peroksildan olingan luminesansni uning antioksidant salohiyatiga mutanosib ravishda kamaytiradi. Biz 60 daqiqa davomida TRAP lyuminesans emissiyasini kuzatdik va taqqoslash uchun standart antioksidant sifatida Troloxdan foydalangan holda namunalarsiz tizimga nisbatan egri chiziq ostidagi maydonni (AUC) hisobladik (bu barcha vaqt nuqtalarida lyuminesans emissiyasining 100% deb hisoblanadi).^( 13 ) Luminesans emissiyasi Micro Beta luminesans hisoblagichida qayd etilgan (Perkin Elmer, Waltham, MA).
Protein glikatsiyasini tahlil qilish
0,02% natriy azid o'z ichiga olgan fosfat tamponida (50 mM, pH 7,4) sigir zardobidagi albumin (BSA, 10 mg/ml) 1, 10 va 100 mkg/ml yakuniy konsentratsiyalarda ekstraktlar bilan oldindan inkubatsiya qilingan. . Reaksiya aralashmasiga glyukoza (25 mM) va fruktoza (25 mM) eritmalari qo'shildi. Barcha reaktivlar va namunalar 0,25 mkm membranali filtrlar orqali filtrlash orqali sterilizatsiya qilindi. Har bir eritma qorong'i joyda 21 kun davomida qopqoqli trubkada 37 ° C da inkubatsiya qilindi. Ushbu davrda BSA glikatsiyasi floresan mahsulotning shakllanishiga olib keldi, uning miqdori florimetrda (F2000, Hitachi Ltd., Tokio, Yaponiya) 350 nm qo'zg'alish to'lqin uzunligi va 450 nm emissiya to'lqin uzunligi bilan aniqlandi. ^{( 14 , 15 )}Glikatsiyani inhibe qilish quyidagicha hisoblandi: Inhibisyon % = 1 – (As – Ab)/(Ac – Ab) × 100, bu erda As = namuna bilan inkubatsiya qilingan aralashmaning floresansi, Ac = namunasiz inkubatsiya qilingan aralashmaning floresansi (ijobiy nazorat) induktsiyalangan glikatsiya uchun) va Ab = bo'sh nazorat sifatida namunaning floresansi. ^( 16 )
Jami fenolik tarkibini aniqlash
Shaftoli va hosilalarining umumiy fenolik miqdori Folin-Ciocalteu usuli yordamida aniqlandi. ^( 17 ) 100 µl namunaga 100 µl Folin-Ciocalteu reaktivi aralashtirildi va keyin 200 µl Na ₂ CO ₃ 35% qo‘shildi. Hajmi o'ta toza H ₂ O bilan 1900 µl ga to'ldirildi va keyin bir hil holga keltirildi. 10 daqiqadan so'ng absorbans 725 nm da o'lchandi va gallik kislota kalibrlash egri chizig'i bilan solishtirildi. Namunalardagi jami fenollar gallik kislota ekvivalenti sifatida aniqlandi. ^( 18 )
Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) orqali karotenoidlarning miqdorini aniqlash
Karotenoid tahlili onlayn degasser, to'rtlamchi nasos va avtomatik injektor bilan jihozlangan HPLC tizimi (Agilent series 1100, Santa Clara, CA) yordamida amalga oshirildi. Karotenoidlar polimerik teskari fazali ustunda (YMC C _{30 250 mkm × 4,6 mkm; zarrachalar hajmi 3 mkm) 5:90 da suv/metanol/MTBE (} Metil tert-butil efir ) bilan boshlangan mobil faza gradienti bilan ajratildi. :5 va 12 daqiqadan keyin 0:95:5, 25 daqiqadan keyin 0:89:11, 40 daqiqadan keyin 0:75:25 va 60 daqiqadan keyin 00:50:50 ga 33 daqiqada 1 ml/min oqim tezligi bilan erishiladi. °C. ^( 19 )Spektrlar 250 va 600 mikron oralig'ida o'tkazildi va xromatogrammalar karotinoidlar uchun 450 nm qattiq to'lqin uzunligida qayta ishlandi. Identifikatsiya har bir namunada olingan eng yuqori saqlash vaqtlarini bir xil sharoitlarda tahlil qilingan standartlarni saqlash vaqtlari va standartlarni birgalikda kiritish orqali taqqoslash orqali amalga oshirildi. Quyidagi konsentratsiya oralig'ida karotinoidlar uchun standart egri chiziqlarni yaratish uchun miqdorlar o'tkazildi: b-karotin uchun 5-4000 mkg/ml, a-karotin uchun 2-200 mkg/ml, to'liq trans-lutein uchun 1-1000 mkg/ml, Kriptoksantin uchun 4–4000 mkg/ml va zeaksantin uchun 1–500 mkg/ml. Standartlar MTBE da eritildi va bir xil sharoitlarda tahlil qilindi. Aniqlash chegaralari (LOD) va miqdor chegaralari (LOQ) Long va Winefordner tomonidan ilgari tasvirlanganidek aniqlangan. ^( 20) Quyidagi LOD va LOQ ko'rsatkichlari mos ravishda olingan: b-karotin uchun 6,5 × 10 ^-2 va 10,9 × 10 ^{-2 mg / kg;}  Lutein uchun 6,9 × 10 ^-3 va 1,2 × 10 ^{-2 mg / kg;} Kriptoksantin uchun 2,1 × 10 ^-2 va 3,5 × 10 ^{-2 mg / kg;}  Zeaksantin uchun 9,6 × 10 ^-2 va 1,6 × 10 ^{-2 mg / kg;}  va a-karotin uchun 2,0 × 10 ^-2 va 3,3 × 10 ^{-2 mg / kg.}
Sitotoksiklik: LDH faolligini o'lchash
To'qima bo'laklarining hujayra hayotiyligi inkubatsiya muhitida LDH faolligi bilan baholandi. Ushbu tahlil ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Labtestdan (Lagoa Santa, Minas Gerais, Braziliya) LDH (kod: 86-2/30) uchun tijorat to'plamidan foydalangan holda amalga oshirildi. 500 nm da absorbansning o'zgarishi SpectraMAX 190 plastinka o'quvchi (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) da kuzatildi.
Oksidlanish stress parametrlari
Katalaza (CAT, EC 1.11.1.6) faolligi 240 nm da spektrofotometrda H ₂ O ₂ absorbansining pasayish tezligiga rioya qilish orqali baholandi . ^( 21 ) SOD ning faolligi namuna buferida superoksidga bog'liq adrenalin avto-oksidlanishini inhibe qilish miqdorini aniqlash orqali o'lchandi; adrenoxrom hosil bo'lishi spektrofotometrda 10 daqiqa (32 ° C) davomida 480 nm da kuzatildi. ^( 22 )
Sulfidril guruhlar miqdorini aniqlash
Tiol guruhlarining oksidlanish holati namunalardagi umumiy qisqartirilgan sulfgidril (SH) guruhlarini miqdoriy aniqlash orqali baholandi. ^( 23 ) Qisqacha aytganda, umumiy SH miqdorini o'lchash uchun 60 mkg namunali alikvot fosfat tampon tuzida (PBS) va 10 mM 5,5'-ditionitrobis 2-nitrobenzoy kislotasida suyultirildi va spektrofotometrda 412 nm da o'qildi. min inkubatsiya.
Lipidlarning peroksidlanishi
Tiobarbiturik kislotaning reaktiv turlarining (TBARS) hosil bo'lishi tiobarbiturik kislota bilan kislotali isitish reaktsiyasi orqali aniqlandi. TBARS hosil bo'lishi lipidlarning oksidlovchi shikastlanishi uchun keng qo'llaniladigan parametrdir. ^( 24 ) Trichloroasetik kislota 10% (TCA) bilan cho'ktirilgandan so'ng, supernatant 2-tiobarbiturik kislota (0,67%) bilan aralashtiriladi va 25 daqiqa davomida qaynoq suv hammomida isitiladi. TBARS 532 nm da spektrofotometrda absorbans bilan aniqlandi.
Protein karbonillanishi
Karbonil guruhlarining hosil bo'lishi dinitrofenilhidrazin (DNPH) bilan reaktsiyaga asoslangan oqsillarni oksidlovchi shikastlanishining parametri sifatida ishlatilgan. ^( 25 ) Proteinlar 10% TCA qo'shilishi bilan cho'ktirildi va DNPHda qayta eriydi. Keyin absorbans spektrofotometrda 370 nm da o'qildi.
O'simta nekrozi omil-a (TNF-a) va interleykin-1b (IL-1b) miqdorini aniqlash
Inkubatsiya muhitida TNF-a va IL1-b kontsentratsiyasini aniqlash uchun biz bilvosita ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA) protsedurasidan foydalandik. Namunalar oqsil tarkibiga qarab normallashtirildi va Elishay plitalariga qo'shildi. Antigen xona haroratida 24 soat davomida inkubatsiya qilindi, 3 marta Tween-Tris buferli sho'r suv bilan yuvildi (TTBS: 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, tarkibida 0,9% NaCl va 0,1% Tween-20) va keyin birlamchi antikor (1: 1000 suyultirish diapazoni) qo'shildi va 24 soat davomida 4 ° C da inkubatsiya qilindi, keyin ikkilamchi antikor inkubatsiyasi (quyon anti-IgG, 1: 1000 suyultirish diapazoni) xona haroratida 3 soat davomida. Immunoreaktivlik (1:1) BD Biosciences kompaniyasining spetrofotometrik aniqlash to'plami yordamida aniqlandi. Reaktsiya sulfat kislota bilan to'xtatildi va namunalar 450 nm da o'qildi. Standart egri hisoblash uchun tozalangan rekombinant TNF-a (Abcam) va IL-1b (BD) ishlatilgan.^( 26 )
Statistik tahlil
O'lchov natijalari o'rtacha ± SEM sifatida ifodalangan. Ma'lumotlar bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) va keyin Tukeyning post hoc testi bilan baholandi. _{Barcha shaftoli namunalari (yangi shaftoli pulpasi, qobig'i, shaftoli pulpasining konservasi va shaftoli siropi konservasi), yakka o'zi inkubatsiya qilinganida (ya'ni, FeSO 4} / H ₂ O ₂ gidroksil hosil qiluvchi tizim mavjud bo'lmaganda) hamma uchun sezilarli statistik ta'sir ko'rsatmadi. bu erda tahlil qilingan parametrlar (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Barcha natijalar GraphPad Prism 5.01 dasturida hisoblab chiqilgan.
O'tish:
Natijalar va muhokama
Funktsional oziq-ovqatlar va ozuqaviy moddalar turli tizimlarda toksiklik, oksidlovchi stress va yallig'lanishga qarshilik ko'rsatish parametrlarini yaxshilash orqali sog'liq uchun foyda keltirishi odatda qabul qilinadi. Shunday qilib, biz buyrak, jigar va miya korteksidan foydalanishni tanladik, chunki bu organlar tanadagi turli tizimlarning vakili bo'lib, sutemizuvchilarda (shu jumladan odamlarda) vositachi metabolizmning asosiy regulyatorlari hisoblanadi. Tajribalar inkubatsiya tizimida kalamush jigari, buyrak va miya po‘stlog‘i bo‘laklaridan foydalangan holda o‘tkazildi, chunki bu tizimli organlardagi birikmalarning biokimyoviy ta’sirini baholashning tezkor usulidir. Ushbu ex vivo modeli organning asl gistologik tuzilishining ko'p qismini saqlab qoladi va shuning uchun uning fiziologik xususiyatlarini saqlaydi. ^{( 10 , 27)}
Biz birinchi navbatda shaftoli va hosila mahsulotlaridan olingan turli namunalarning umumiy antioksidant qobiliyatini baholadik. Biz FPP, peel, PPP va shaftoli siropining liyofillangan namunalarini suvda bir xil konsentratsiyada (20 µg/ml) to‘xtatib qo‘ydik va ularni TRAP tahliliga o‘tkazdik. Ushbu tahlil o'simlik ekstraktlarida ferment bo'lmagan antioksidant qobiliyatini aniqlash uchun keng qo'llaniladi, bu asosan redoks faolligi bilan ikkilamchi metabolitlarning tarkibiga bog'liq. ^( 13 ) Natijalar boshqa namunalar bilan solishtirganda peeling eng yuqori antioksidant faolligiga ega ekanligini ko'rsatdi; FPP ham sezilarli antioksidant quvvatga ega edi (2-rasm). 2A va B). PPP va sirop sezilarli ta'sir ko'rsatmadi. Standart antioksidant sifatida a-tokoferolning hidrofilik analogi Trolox (200 nM) ishlatilgan.





2-rasm
Antioksidant va glikatsiyaga qarshi profil. Yangi shaftoli pulpasi (FPP), qobig'i, konservalangan shaftoli pulpasi (PPP) va siropning liyofillangan namunalarining teng konsentratsiyasi (20 mkg/ml) solishtirildi. (A) Umumiy reaktiv antioksidant potentsial (TRAP) "material va usullar" bo'limida tavsiflanganidek bajarildi va egri chiziq ostidagi maydon hisoblandi. "Tizim" peroksil-radikal ishlab chiqarish tizimini bildiradi. Taqqoslash uchun standart antioksidant sifatida Trolox ishlatilgan. (B) Xemiluminesans intensivligining kinetikasi (daqiqada % hisoblash [CPM]) ham tasvirlangan. (C) Namunalar tizimga qo'shilganda kimyoluminesansning bir zumda pasayishi bilan hisoblangan TAR indeksi xuddi shu tahlildan hisoblab chiqilgan. ***Tizimdan farqli ( p <0,0001), ^# sirop va PPP guruhlaridan farq qiladi ( p<0,0001). (D) 1,10 va 100 mkg/ml da FPP, peel, PPP yoki sirop ishtirokida 21 kun davomida glyukoza va fruktoza bilan in vitro albumin glikatsiyasining ulushi. * Bir tomonlama ANOVA (Tukey's post hoc) yordamida glikatsiya bilan qo'zg'atilgan guruhdan farqli ( p <0,0001), ^# glikatsiya bilan qo'zg'atilgan guruhdan va yulduzcha bilan belgilangan guruhlardan farq qiladi ( p <0,05). Grafik chiziqlardagi qiymatlar o'rtacha ± SEMni (uchlik tajribalar) ifodalaydi.
Umumiy antioksidant reaktivlik (TAR) indeksi peroksil ishlab chiqaruvchi tizimga namuna qo'shilishi bilan bog'liq lyuminesansning bir zumda pasayishini ko'rsatadi. TRAP o'simlik ekstraktlarida mavjud bo'lgan antioksidantlar miqdorini ko'rsatsa, TAR ularning antioksidant samaradorligini ko'rsatadi. Peel va FPP PPP va siropga nisbatan eng yuqori TAR indekslariga ega edi (1-rasm). 2C). Bu natija shuni ko'rsatadiki, ham FPP, ham po'stlog'i sezilarli antioksidant faollikka ega bo'lgan molekulalarning yuqori tarkibiga ega, bu avvalgi ishlarda ko'rsatilganidek, ikkilamchi metabolitlarning tarkibi bilan bog'liq. ^( 28 ) Poʻstlogʻi va FPPni boshqa namunalar bilan solishtirganda, yangi meva namunalari (yaʼni, poʻstlogʻi va FPP) konserva namunalariga (PPP va sirop) nisbatan yuqori antioksidant faollikka ega ekanligi ayon boʻladi. Ushbu topilmalar shaftolining ba'zi xususiyatlari konservalar tomonidan vaqt o'tishi bilan yoki qayta ishlash jarayonida yo'qolishini ko'rsatadi, bu sanoatlashtirilgan/konservalangan mevalarning biologik xususiyatlari yangi mevalarga qaraganda pastroq ekanligini ko'rsatadigan oldingi kuzatuvlarga mos keladi. ^( 29 )Yangi shaftolining yuqori antioksidant potentsiali uning vaqt o'tishi bilan saqlanish qobiliyati bilan bog'liq bo'lishi mumkin, chunki ma'lumki, antioksidantlar oziq-ovqatning ta'mi va ozuqaviy qiymatini saqlab qolishga yordam beradi. Shu sababli, tabiiy va sintetik antioksidantlar oziq-ovqat mahsulotlarini saqlash sanoatida keng qo'llaniladi va siropga asoslangan shaftoli konservalarida ular vaqt o'tishi bilan oksidlanish va oksidlanishning ozuqaviy qiymatining boshqa tarkibiy qismlarini saqlab qolish va natijada degradatsiyaga olib kelishi mumkin.
Glikatsiya - qaytaruvchi shakar va uzoq umr ko'radigan oqsillar va lipidlar o'rtasidagi o'z-o'zidan fermentativ bo'lmagan aminokarbonil reaktsiyasi. Glikatsiya biomolekulalarning kimyoviy modifikatsiyalarining asosiy shakllaridan biri bo'lib, ularning funktsiyasini buzadi va yaqinda diabet, yurak-qon tomir patologiyalari va neyrodegenerativ kasalliklar kabi bir qancha kasalliklarning molekulyar asosiga ta'sir ko'rsatadi. ^( 30 ) Ushbu kimyoviy modifikatsiyalar tez-tez rivojlangan glikatsiyaning yakuniy mahsuloti (AGE) hosil bo'lishiga olib keladi. Glikatsiya oksidlovchi stressni keltirib chiqaradigan reaktiv kislorod turlarining (ROS) manbai bo'lib, bu o'z navbatida yallig'lanish vositachilarining ishlab chiqarilishi va chiqarilishiga olib kelishi mumkin. ^( 31 )Bundan tashqari, AGE va oksidlovchi stress hujayralardagi ilg'or glikatsiyaning yakuniy mahsuloti (RAGE) uchun retseptorlarning ekspressiyasini kuchaytiradi, bu esa yallig'lanishga qarshi yo'llarni va NADPH oksidazadan olingan ROS ishlab chiqarishni faollashtiradi. ^( 32 ) Antioksidantlar shakarning oqsillar bilan oksidlanish reaktsiyasini oldini olish va shu bilan AGE shakllanishining dastlabki bosqichi bo'lgan Amadori mahsulotlarining shakllanishiga to'sqinlik qilishi haqida xabar berilgan. ^( 15 ) Bir nechta hisobotlar shuni ko'rsatadiki, radikallar va yuqori reaktiv oksidlovchilar ishlab chiqarish fiziologik sharoitda glyukozalangan oqsillar tomonidan ko'payadi. ^( 15 )Biz izolyatsiya qilingan albuminni 21 kun davomida glyukoza va fruktoza bilan inkubatsiya qilish orqali glikatsiya protokoliga o'tkazdik. Inkubatsiya davrining oxirida albumin glikatsiyasi turli dozalarda peel va FPP tomonidan 40% ga sezilarli darajada inhibe qilindi (2-rasm). 2D). PPP, shuningdek, albumin glikatsiyasini inhibe qildi, lekin pastroq darajada (taxminan 10%), siropning o'zi esa, ehtimol, yuqori saxaroza miqdori tufayli (20% dan ortiq), glikatsiyani 30% ga kuchaytirdi.