Правила стерильной работы

Ламинарный бокс (ламинар)- приспособление для работы в стерильных условиях. Асептические условия в ламинаре создаются с помощью тока воздуха. Ламинарное движение воздуха - движение, при котором струйки воздуха двигаются параллельно, обтекая препятствие равномерными слоями. Ток воздуха, проходя через ламинар, движется к исследователю, что позволяет освобождать внутреннее пространство ламинара от спор микроорганизмов.
Другое название ламинарного бокса - установка обеспыливания с горизонтальными или вертикальными потоками воздуха (УО-БГ или УО-БВ, Ужгород или КПГ-1М, Псков; БАВ-”Ламинар-С”-1, 2 - Челябинская область).
Как изготовить микробиологическую пробку
Для предотвращения заражения культур из воздуха и их преждевременного высыхания пробирки и колбы закрывают пробками. Пробки для посуды условно можно разделить на ватные (традиционные микробиологические) и крышечки из фольги.
С ватными пробками проще работать начинающим - меньше риска получить ожог. Пробки должны плотно входить в пробирку (колбу) на 2-3см, или на 2/3 своей длины; при открывании хорошо закрытой посуды раздается характерный хлопок.
Недостки микробиологических пробок - довольно трудоемки в изготовлении, часто прожигаются, не очень удобны при долговременном культивировании. Если для микробиологических культур сроки культивирования редко превышают 2 недели, то для растительных клеток продолжительность субкультивирования - как минимум 3 недели. За это время среда начинает подсыхать. Поэтому в таких случаях важно закрывать ватную пробку сверху герметично парафильмом или пищевой пленкой.
Крышечка из фольги проще в работе - легко изготавливается (вырезается кружочек или квадратик по диаметру горлышка пробирки или колбы + один полтора сантиметра для отгибания вниз).
Фольгу нужно брать плотную. Если нет плотной - тонкая фольга складывается в 3-4 раза. При обжигании краешков такой пробки нужно быть аккуратным, чтобы не получить ожог, так как фольга металлическая и хорошо проводит тепло. После одевания пробки самый краешек, загнутый вниз на пробирку или колбу, оборачивается узенькой полоской парафильма или пищевой пленки в 2-3 оборота, таким образом краешки плотно прилегают к посуде, и крышка держится надежнее, герметичнее закрывает, снижается риск контаминации (занесения посторонней микрофлоры).
Изготовление микробиологической пробки
Сложить вдвое кусок марли, накрыть им верхнюю часть пробирки. На середину куска, закрывающего отверстие пробирки, положить вату, протолкнуть в пробирку на глубину примерно 3-4 см. Вату очень плотно утрамбовать, затем концы марли скрутить в центре, обвязать ниткой, лишнее обрезать. Обрезки марли можно использовать вместе с ватой при изготовлении пробок. Проверить качество пробок: хлопок в момент открывания пробирки, очень твердая (“каменная”) на ощупь.
Для колб пробки готовят следующим образом: прямоугольный слой ваты скатать в виде очень плотного, до твердости валика нужных размеров, учитывая диаметр и длину горла колбы, обернуть его двойным марлевым слоем.
Стерильная работа в нестерильных условиях
Наличие ламинара или ламинарного бокса - это отлично, просто замечательно. Но что делать, если его нет? Или появится в обозримо-необозримом будущем, а культуры клеток заводить нужно уже сейчас?
Шаг первый - постарайтесь найти малопосещаемое людскими массами помещение - чем меньше посетителей - тем меньше источников загрязнения.
Шаг второй - всегда перед работой проводите влажную уборку всей комнаты и стерилизуйте ее кварцевой (ультрафиолетовой) лампой.
А теперь, собственно - о рабочем месте. В нашем случае оно выглядело примерно так: стол, покрытый ламинатом. Лучше - железный, но сойдет и покрашенный масляной краской. В идеале - поверхность стола должна быть негорючей. Именно поэтому железный стол - лучше всего. Ламинат тоже загорается не сразу, хуже всего в этом отношении масляная краска, а еще пуще всякие дерматины и сукно. Они противопоказаны категорически.
Прямо перед вами на столе должны лежать следующие предметы: кафельная плитка или кусок стекла размером 15х15 см или чуть больше. Кафельная плитка - лучше, она выдерживает нагрев, а стекло может лопнуть. Спиртовка, стаканчик с 96% спиртом (или 200-300 граммовая высокая баночка из-под кофе, детского питания, фруктовых пресервов), широкая кисточка для рисования, мокрая марлевая салфетка или тряпочка размером 30Х30, свернутая в несколько раз (смочена водой! ), пинцет, скальпель, пробирки/баночки с питательной средой, пробирки/чашки Петри с материалом для размножения.
Порядок работы: протираете влажной тряпочкой поверхность стола, ополаскиваете тряпочку и выжимаете ее. Кладете свернутую под ПРАВУЮруку, справа от кафельной плитки. Располагаете подручные средства. Кафельная плитка лежит прямо перед вами, в центре рабочего места. За кафельной плиткой по центру стоит спиртовка. Рядом с ней, на расстоянии 10 см или чуть больше стоит стаканчик со спиртом, получается, он будет находиться сразу за тряпочкой справа от вас. Слева от плитки располагаются пробирки со средой и материал, который вы будете вводить в культуру или пассировать. Расстояние от плитки до среды и от плитки до тряпочки не менее 10 см влево и вправо, соответственно. Скальпель и пинцет погружены в спирт примерно на 2/3 своей длины (поэтому важно, чтобы баночка была узкой и высокой и была почто до верха наполнена спиртом. Кисточка также стоит в стаканчике со спиртом.
Берете кисточку, мажете спиртом поверхность плитки. Ставите кисточку в спирт. Зажигаете спиртовку, вынимаете скальпель, поджигаете в пламени спиртовки и поджигаете горящим скальпелем спирт на поверхности плитки. Кладете скальпель справа на кафельную плитку (она может еще продолжать гореть) так, чтобы острие скальпеля смотрело вверх (то есть на ребро плитки), но так, чтобы большая часть скальпеля, включая острие, находилось именно над плиткой, в пламени. Правой рукой берете пинцет из баночки со спиртом, перекладываете в левую руку, поджигаете от спиртовки и кладете слева на плитку - аналогично скальпелю. ВНИМАНИЕ - если вы проводите эти процедуры впервые - отрабатывайте навыки, окуная инструменты в спирт на четверть длины и пугайтесь пламени, оно исчезает в течение минуты. Влажная тряпочка - ваша страховка на случай, если вы подожжете что-то не то, например, запаникуете и бросите горящий инструмент в баночку со спиртом. Тогда сразу накрывайте влажной тряпкой источник огня, без доступа кислорода огонь тухнет моментально.
В результате этих манипуляций вы имеете абсолютно стерильную поверхность плитки со стерильными инструментами на ней. Постарайтесь контролировать свои движения и доставать экспланты, открывать пробирки не над плиткой непосредственно, а в зоне между плиткой и горящей спиртовкой, то есть за плиткой. На стерильной плитке вы можете резать эксплант, класть его пинцетом на кончик скальпеля для последующего переноса на питательную среду и она должна оставаться стерильной. Старайтесь не трясти над ней рукавами халата. Использованные инструменты снова погружаете в спирт. Перед каждым новым эксплантом все операции по стерилизации, начиная с обжигания поверхности плитки, повторяются. Помните, что скальпель вы держите указательным и большим пальцем (он лежит на указательном и среднем, зажатый большим пальцем, а крышки с пробирок снимаете мизинцем, предварительно пронеся горлышко пробирки через пламя спиртовки.