Правила стерильной работы

Стерилизация растительного экспланта
Стерильная культура - культура, свободная от эпифитных и ризосферных микроорганизмов.
Работающий должен вымыть руки с мылом и протереть их спиртом, надеть стерильный халат, завязать волосы стерильной косынкой.
Перед стерилизацией объекта его тщательно моют теплой водой с мылом, промывают дистиллированной водой, очищают от излишних тканей, снимают кожуру у корнеплодов и корней, кору у побегов, поверхностные листья у верхушек побегов, промывают дистиллированной водой и помещают на несколько секунд в 70% спирт (семена на 1-2 минуты). После этого сегменты корней, побегов, стеблей, клубней или семена переносят в стерилизующий раствор.
Вид стерилизующего агента, его концентрация и время действия, зависящие от особенностей тканей исходных растений, необходимо подобрать таким образом, чтобы убить микроорганизмы и не повредить ткани экспланта. Для поверхностной стерилизации растительных объектов применяют следующие средства стерилизации: сулему (двуххлористая ртуть) (0.1%), хлорамин (2-10%), гипохлорит кальция (7-10% Ca(ClO)₂) или натрия (NaOCl), перекись водорода (13-18%) и др. Хлорамин можно купить в аптеке. Для стерилизации можно использовать также хлорсодержащие растворы отбеливателей из хозяйственных магазинов, например, средство " Белизна". Свежие растворы отбеливателей при стерилизации нежных эксплантов, таких как молодые листочки, нужно разводить в 2 или даже в 3 раза. Эффективность стерилизации возрастает при добавлении нескольких капель твина-80 и твина-20 на литр стерилизующего раствора.
Продолжительность стерилизации меристем сулемой - 5 минут, семян - 15-20 минут, пергидролем соответственно 15 и 30 минут.
После стерилизации материал переносят в стерильную дистиллированную воду, выдерживают 10 минут, затем меняют воду ещё два раза, выдерживая в каждой порции по 15-20 минут. В стерильных чашках Петри или на стерильных листах бумаги, или на обожженной кафельной плитке обрезают стерильным скальпелем концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены, и из средних зон нарезают кусочки тканей, которые высаживают на инициальную среду для образования каллусов. При стерилизации отрезков стебля или верхушечных почек в растворах сулемы или гипохлорита рекомендуется парафинировать срезы, чтобы стерилизатор не проник в сосуды, что может привести к интоксикации ткани.
Питательные среды для растительных биотехнологических объектов
Успех в культивировании объектов зависит от правильного выбора питательной среды и тщательности её приготовления. В состав питательных сред входят макро- и микроэлементы (N, P, K, Ca, S, Mg, Fe, B, Zn, Cu, Co, Mn, J, Mo); витамины В₁, В₆, В₁₂, РР и другие; углеводы (сахароза, глюкоза, маннит); фитогормоны (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении). Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, цитокинины индуцируют деление дедифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей. На средах без гормонов растут “привыкшие” и опухолевые ткани.
Для получения стеблевого морфогенеза снижают содержание ауксинов. Из ауксинов чаще всего применяют 2, 4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2, 4-Д) - 0.1-10 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0.1-2 мг/л, ИУК - 1-30 мг/л.Для индукции каллусогенеза используют более высокие концентрации ауксинов, в дальнейшем ткань может расти при более низком содержании ауксинов.В качестве цитокининов используют кинетин, 6-бензиламинопурин (БАП), зеатин (0.001-10 мг/л); из них кинетин наименее активен. В состав некоторых сред входит аденин. Иногда используют гибберелловую кислоту (ГК). В качестве рост активаторов применяют также кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и др. Состав питательных сред для культивирования биотехнологических объектов зависит от типа их питания: - среда без глюкозы - для хлореллы, цианобактерий; - среда без витаминов и гормонов - для грибов (фузариума, ботритиса) и для ряски (Lemna);
- среда с азотом, сахарами, витаминами и гормонами - для культивирования клеток и тканей высших растений.
Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Составы питательных сред, получивших наибольшее распространение приведены в справочниках по физиологии растений и биотехнологии. На сайте вы найдете прописи для базовых сред для культивирования растительных клеток: среда Мурасиге-Скуга и среда Гамборга, некоторые микробиологические среды.
Последовательность приготовления питательных сред для растительных клеток
Составление питательной среды начинают с приготовления концентрированных (маточных) растворов. Почему готовят маточные растворы, а не отвешивают соли для приготовления 1 среды? Для удобства - чтобы не взвешивать все необходимые соли всякий раз, когда вздумается завести культуру. С другой стороны, концентрированные растворы менее подвержены опасности быть съеденными микроорганизмами, которая существует даже при хранении разбавленных растворов в холодильнике. Ведь соленые огурцы у вас хранятся гораздо дольше, чем свежие. Вторая причина, по которой мы готовим маточные растворы - снижение погрешности при отмеривании необходимого количества солей. Согласитесь, взвесить 5 граммов проще, чем 50 миллиграммов - во всяком случае мерную емкость, которой потом можно будет отмерить 5, 10 или 20 миллилитров найти проще, чем аналитические весы. Обычно готовят несколько маточных растворов - макроэлементы, хелатное железо, микроэлементы, хлористый кальций, витамины, хранят их в отдельных колбах, а при приготовлении среды сливают в той последовательности, в какой они перечислены выше. Делается это для того, чтобы при взаимодействии солей не происходило образование осадка. Макросоли взвешивают на технических весах, растворяют по отдельности в небольшом количестве бидистиллята и доводят в цилиндре до объема, в 10 меньшего, чем требуется по прописи среды, т.е. на 1 литр общего объема питательной среды берут 100 мл раствора макросолей. Иногда эта пропорция изменяется, и концентрация увеличивается не в 10 раз, а более, соответственно меняется и объем маточного раствора, который берется для приготовления 1 литра питательной среды. Например, если мы готовим 1 литр (1000 мл) маточного раствора, увеличивая концентрацию солей в нем в 20 раз (масса навески каждой соли * 20), то для приготовления среды берется 50 мл такого концентрированного раствора (как в случае среды Мурасиге-Скуга). Таким образом, вэтим 1 литре маточного раствора у нас 20 порций по 50 мл для приготовления 20 сред (20*50=1000). Если концентрация увеличивается в 25 раз, то берется 40 мл и т.д. Навески микросолей для хелатного железа растворяют по отдельности, смешивают и доводят до объема с конечной концентрацией 50 мл/л. Раствор должен получится ярко-желтого цвета, рН 8.0. Неправильное приготовление хелатного железа может привести к выпадению в осадок после автоклавирования фосфатов кальция или магния. Навески микроэлементов взвешивают на аналитических весах, растворяют так, чтобы конечная концентрация соответствовала 5 мл раствора на 1 литр готовой среды, то есть для приготовления питательной среды мы будем брать по 5 миллилитров. Полученные растворы сливают в склянки с притертыми крышками, снабжают этикеткой и хранят в холодильнике. Железо - хелатный комплекс хранят в темной склянке. Витамины готовить несколько сложнее. Самая большая проблема - правильно определить, сколько же граммов или миллиграммов искомого вещества может содержать капсула с витамином. Обычно на коробочке пишут 1%, 5%, 6% раствор тиамин - хлорида, никотиновой кислоты или другого необходимого вам витамина. Это означает, что для его приготовления 1% раствора было взято 1000 миллиграмм вещества, которые растворили в 100 мл воды. Следовательно, каждый миллилитр этого раствора содержит 10 миллиграммов витамина. Стандартная аптечная расфасовка - капсулы по 1 миллилитру. Значит, в каждой капсуле содержится 10 миллиграммов витамина, если это 1% раствор, 50 мг - если 5%. Если вам требуется 10 миллиграммов определенного витамина, а вы имеете в распоряжении капсулу объемом 1 мл, содержащую 50 мг вещества, то что вы сделаете? Правильно - добавите содержимое этой капсулы в мерный цилиндр, доведете объем до 50 мл (лучше всего вытянуть раствор из капсулы шприцем и потом несколько раз промыть дистиллятом и шприц, и капсулу, сливая воду в цилиндр, где вы производите разбавление. И уже разведенного раствора вы возьмете 10 миллилитров. Витамины разливают по 5 мл в пенициллиновые флакончики или пробирки, ставят в морозилку и хранят в замороженном виде. Концентрированные растворы готовят с расчетом добавления 5 мл на 1 литр среды. При составлении среды флакончик с витаминами достают из холодильника, размораживают, опуская в горячую воду, и выливают в колбу с питательной средой. Фитогормоны (ауксины и цитокинины) сначала растворяют в 2 мл 96^oC этилового спирта (или 0.1 н NaCl) и добавляют 98 мл воды, доводя объем до 100 мл, хранят при температуре 2-4^оС. Гиббереллин легко растворим в воде.
Вопросы по теме:
1. Каковы правила организация биотехнологической лаборатории, стерильной работы.
2. Что такое ламинарный бокс?
3. Как проводят стерилизацию растительного экспланта?
4. Какие вы знаете питательные среды?