«Производство лекарственных средств и вспомогательных веществ как продуктов первичного метаболизма. Получение аминокислот, органических кислот, витаминов»

Микробиологический синтез
Микробиологический синтез витаминов и коферментов все шире включается в новые технологические схемы. Использование достижений в области физиологии микроорганизмов — продуцентов БАВ — позволяет оптимизировать биосинтез и увеличивать их выход. Использование в промышленности указанных методов дает возможность применять более дешевые источники сырья, увеличивать выход продукции, заменять дорогостоящие и трудоемкие стадии химического синтеза.
Большинство органических кислот получают химическими методами из продуктов переработки нефти и сухой перегонки древесины. Однако, когда кислота используется для пищевых или медицинских целей или синтез ее является сложным, целесообразно использовать микробиологические методы. Сейчас лимонную, глюконовую, кетогулоновую и итаконовую кислоты получают только микробиологическим путем, а молочную и уксусную — как химическим, так и микробиологическим методами. Многие из этих кислот либо сами являются ЛВ, либо используются в качестве исходных продуктов их синтеза или получения солей. Основным сырьем для производства органических кислот ранее служили углеводы (глюкоза, сахароза, крахмал). Начиная с 60-х гг. XX в. для этой цели все шире используется непищевое сырье — нормальные парафины нефти в сочетании со специально селекционированными штаммами дрожжей.


Биотехнология аминокислот
Аминокислоты являются составными элементами белков. Все 20 аминокислотявляются мономерами для построения природных полипептидов и хорошо изучены (методы их синтеза давно подробно описаны). Известно также, что эти соединения существуют в виде оптических изомеров (вспомните теорию строения органических соединений Бутлерова А.М., открывшего ассиметрию атома углерода с четырьмя заместителями, определяющими направление и степень вращения плоскости поляризованного света) .
Современные методы органического синтеза позволяют синтезировать L- и D-формы аминокислот, но только как рацематы, дальнейшее разделение которыхпредставляет трудную задачу и экономически не эффективно.
Другой способ получения аминокислот – это микробиологический синтез, когда используют штаммы-продуценты, осуществляющие сверхсинтез аминокислот. Избыточные количества аминокислот, например, L -лизина, L –глутаминовой кислоты, L -треонина, L –трептофана экскретируются (выходят) в культуральную (внешнюю) среду. Культуральная среда в этом случае можетсодержать от четырех, пяти и до ста граммов целевой аминокислоты на одинлитр жидкой фазы. В отличие от химического синтеза, в этом случае, то есть прибиосинтезе аминокислот с помощью ферментных систем микроорганизмов,получаются исключительно L-формы аминокислот, обуславливающих терапевтический эффект, а не рацематы. Это обстоятельство решает проблему выбора получения аминокислот в промышленном масштабе в пользу биотехнологических методов.
Аналогичная ситуация сложилась и в области производства антибиотиков. Химический синтез, как правило, не эффективен. Именно поэтому в фармацевтической промышленности антибиотики получают с помощью штаммов-продуцентов, которые генерируют нужный антибиотик в определенной фазе роста в заданном режиме культивирования. Однако, использование вдальнейшем химической трансформации природных антибиотиков рождаетновые лекарственные средства и помогает преодолевать резистентностьмикроорганизмов к лекарственным препаратам, повышая эффективностьлечения.

Сегодня известны 4 метода получения аминокислот:

1. химический метод (тонкий органический синтез)
2. химико-энзиматический метод (энзиматическая трансформация химически синтезированных предшественников аминокислот с образованием биологически активных L-изомеров). Метод достаточно дорогой.
3. биологический метод (применение гидролиза белоксодержащих субстратов)
4. прямой микробиологический метод (получение L-аминокислот). Методболее дешевый, экономически выгодный.

Наиболее распространенными методами получения аминокислот являются химико-энзиматический и микробиологический.

В качестве примеров использования химико-энзиматического метода можно привести:

• синтез аспарагиновой кислоты из фумаровой (используются клетки
Escherichiacoli)
• синтез L-фенилаланина из коричной кислоты (используются клетки
дрожжей).
Имея задачу получения аминокислот, используя природные микроорганизмы,надо помнить о механизмах регуляции биосинтеза по принципу обратной связи (ретроингибирование). Эта регуляция осуществляется либо за счетингибирования активности одного из начальных ферментов собственногосинтеза избыточным продуктом, то есть самой аминокислотой, либорепрессируется весь комплекс ферментов всей биохимической цепочкиметаболизма клетки, что является естественной реакцией живогомикроорганизма-продуцента для сохранения собственного равновесия наклеточном уровне. Таким образом перед биотехнологом стоит задача в нарушении этих механизмов, чтобы иметь возможность получить целевойпродукт в необходимых количествах.
Как это делается, можно рассмотреть на примере продуцентов лизина (Corynebacteriumglutaminicum) итреонина (Escherichiacoli).
У Corynebacteriumglutaminicum есть принцип согласованного ингибированияферментативной активности, что является особенностью биосинтеза предшественника лизина. Ингибирование синтеза лизина в клеткевозможно только при повышенной концентрации обеих конечных продуктов –лизина и треонина. Самостоятельно ни лизин, ни треонин не ингибируют активности ключевого фермента –аспартакиназы. Они ингибируют этот синтезтолько вместе. Таким образом, вызвать сверхсинтез лизина можно лишь нарушив синтез треонина или его предшественника – гомосерина.
Действительно, большинство продуцентов лизина не способны синтезировать гомосерин или треонин, то есть являются «ауксотрофами» по этим аминокислотам.
Таким образом большинство продуцентов лизина нуждается в присутствии гомосерина или треонина, иначе они работать не будут. Зная это, биотехнолог, выращивая такие продуценты, должен обязательно вносить в питательнуюсреду от половины грамма и до полутора граммов на один литр гомосерина или треонина. В этом случае происходит активный рост биомассы продуцента безсинтеза лизина. Как только треонин исчезает из среды и рост биомассыпрекращается, начинается активный синтез лизина. Таким образом, данныйпроцесс имеет две стадии развития:
1. рост биомассы
2. синтез лизина
Продолжительность синтеза составляет 2-3 суток. Уровень накопления продукта составляет 50-100 граммов на литр. Это особенности биосинтезализина.
Второй пример. Минтезтреонина. Особенности регуляции биосинтеза треонина в клетках Escherichiacoli (кишечной палочки). В этом случаеситуация другая. У кишечной палочки нет механизма согласованногоингибирования ферментативной активности, то есть, если лизин ингибируетактивность своих ферментов по принципу обратной связи, то треонин – своихферментов. Кроме того, имеет место «репрессия» всего комплекса треониновых ферментов при избытке треонина или изолейцина и это похоже на«согласованную репрессию» Самостоятельно (по отдельности) ни треонин, ни изолейцин не репрессируют синтез ферментов.
Для решения задачи получения треонина в необходимых количествах пришлось сделать следующее:
1. изменить, сделать нечувствительным к треонину первый ферменттреонина
2. снизить активность фермента, синтезирующего из треонина изолейцин
3. убрать механизм репрессии при недостаточном количестве изолейцина не смотря на избыток треонина
4. применить генную инженерию (выделить треониновые гены и размножить их на плазмидах в клетке микроорганизма, резко повысив синтез треонина клетками продуцента)

В рассматриваемом случае синтез треонина отличается от синтеза лизинатем, что его синтез происходит одновременно с ростом биомассы. Здесь уже нет двух стадий.

Особенности культивирования штаммов-продуцентов аминокислот приводят к следующему результату:
1. достигаются максимально высокие скорости синтеза аминокислотклетками продуцента
2. достигается максимальная длительность работы продуцента
3. минимально образуются побочные продукты биосинтеза аминокислот.

Первая задача решается путем выращивания высокоактивной биомассы ипомогают в этом случае наличие в питательной среде:

• 
  источников углерода,
  
• 
  аммонийного азота,
  
• 
  минеральных солей,
  
• 
  ростовых факторов;
  
• 
  оптимизация рН (кислотность среды)
  
• 
  температуры;
  
• 
  дробная подача субстратов.
  

Для предотвращения закисления среды проводят автоматическое рН-статирвоание аммиачной водой и источниками углерода.
В случае биосинтеза лизина добавляют ростовые факторы по меренеобходимости, что зависит от самого сырья, от аппаратуры, от температуры.Процесс биосинтеза энергоемкий и требует интенсивной аэрации иперемешивания.
Для длительной работы ауксотрофных продуцентов лизина в питательнуюсреду вносят комплексный источник аминокислот (белковые гидролизаты).
Внимание! Синтез нужной аминокислоты может прекращаться, если на еепродуцент действуют его токсические метаболиты, которые синтезируютсясамим продуцентом. Например, в процессе биосинтеза фенилаланина, продуцентом которого является Bacillussubtilis, этот продуцент синтезирует примеси ацетоина и бутандиола, в результате этого клетки продуцента лизируются, образуют споры и прекращают вырабатывать фенилаланин. Чтобыизбежать это явление, необходимо ферментацию вести в условиях лимита(ограничения) по источнику углерода. В этом случае весь сахар расходуется только на синтез фенилаланина, увеличивая как количество (в два раза), так ичистоту получаемого продукта.

Как итог можно сказать, что:

- эффективность использования субстрата при биосинтезе аминокислот зависит от продуктивности биомассы,
- если синтез аминокислот разобщен с ростом биомассы (лизин), то эффективность использования субстрата будет тем выше, чем дольше будетработать культура после остановки роста,
- если же синтез аминокислоты идет параллельно росту биомассы (треонин), то эффективность биомассы можно увеличить добавляяопределенное количество предшественников.

Наиболее перспективным направлением являются методы генетической инженерии – введение в клетку продуцента многокопийных плазмид, содержащих гены, контролирующие биосинтез аминокислот в ущерб синтезубиомассы и других клеточных компонентов.

С помощью гибридных плазмид в биосинтезе аминокислот мы получаем:

1. рост продуктивности биомассы.
2. исчезновение примесей (более чистый продукт).
3. возрастает коэффициент использования субстрата (его минимум даетмаксимум продукта).