Transkriptom tahlili rnk sifatiga bog'liq

Reja

Butun transkriptom tahlili genetik variantlarning o'zgargan ifodasi saraton, diabet va yurak kasalliklari kabi murakkab kasalliklarga qanday hissa qo'shishini tushunishda tobora ortib bormoqda. Genom bo'ylab differensial RNK ifodasini tahlil qilish tadqiqotchilarga hujayra taqdiri, rivojlanishi va kasallikning rivojlanishini tartibga soluvchi biologik yo'llar va molekulyar mexanizmlar haqida ko'proq ma'lumot beradi.

Thermo Fisher Scientific tadqiqotingiz uchun butun transkriptom tahlilining murakkabligini aniqlashga yordam berish uchun RNK izolatsiyasi va mikroarray yorliqlash reagentlaridan tortib keyingi avlod sekvensiya reagentlari va asboblarigacha bo'lgan keng assortimentdagi mahsulotlarni taklif etadi.

Transkriptom tahlili RNK sifatiga bog'liq

RNK-seq odatda RNK izolyatsiyasidan, RNKni komplementar cDNKga aylantirishdan, ketma-ketlik kutubxonasini tayyorlashdan va nihoyat, NGS sekvensiyasidan iborat.

RNK izolyatsiyasidan so'ng, RNK sifatiga odatda RNK yaxlitlik raqami (RIN) beriladi. 1 (eng past sifat) va 10 (eng yuqori sifat) oralig'ida bo'lgan ushbu RIN baholari RNK-Seq tajribalari uchun juda muhim, chunki past sifatli RNK namunalari (RIN <6) ketma-ketlik natijalariga ta'sir qilish ehtimoli yuqori, bu noto'g'ri xulosalarga olib kelishi mumkin.

Buzilmagan RNKni izolyatsiya qilish gen ekspressiyasini tahlil qilishda qo'llaniladigan ko'plab usullar uchun zarurdir. Shimoliy tahlil, cDNK kutubxonasi qurilishi va mikroarray tahlili uchun cDNK yorlig'i (ayniqsa, oligo(dT) bilan astarlanganda) juda yuqori yaxlitlikka ega RNKni talab qiladi. RT-PCR va ribonukleaza himoyasi tahlillari ikkalasi ham RNKning kichikroq hududlarini (odatda 1 kb dan kam) tahlil qilishni o'z ichiga oladi va shuning uchun qisman buzilgan RNKga nisbatan bardoshlidir. Pastki oqim dasturidan qat'i nazar, gen ekspressiyasini tahlil qilishdan oldin RNK yaxlitligini tekshirish yaxshi fikrdir.
Agaroz jellari
Umumiy RNKning yaxlitligini baholashning eng keng tarqalgan usuli bu RNK namunasining alikotini etidiy bromid (EtBr) bilan bo'yalgan denaturatsiya qiluvchi agaroz jelida ishlatishdir. Mahalliy (denaturatsiyasiz) jellardan foydalanish mumkin bo'lsa-da, natijalarni izohlash qiyin bo'lishi mumkin. RNKning ikkilamchi tuzilishi o'zining haqiqiy o'lchamiga ko'ra ko'chib ketmasligi uchun mahalliy jellardagi migratsiya sxemasini o'zgartiradi. Denaturatsiya qilinmagan sharoitlar, shuningdek, o'tkir bo'lmagan tasmalar va hatto bitta RNK turining turli tuzilmalarini ifodalovchi bir nechta tasmalarga olib keladi.

Denaturatsiya qiluvchi jelda ishlaydigan buzilmagan jami RNK o'tkir, aniq 28S va 18S rRNK chiziqlariga ega bo'ladi (eukaryotik namunalar). 28S rRNK diapazoni 18S rRNK tasmasidan taxminan ikki baravar intensiv bo'lishi kerak (1-rasm, 3-qator). Bu 2:1 nisbat (28S:18S) RNKning toʻliq buzilmaganligidan yaxshi dalolat beradi. Qisman degradatsiyaga uchragan RNK bulg'angan ko'rinishga ega bo'ladi, o'tkir rRNK tasmasi bo'lmaydi yoki yuqori sifatli RNKning 2:1 nisbatini ko'rsatmaydi. To'liq degradatsiyaga uchragan RNK juda past molekulyar smear shaklida paydo bo'ladi (1-rasm, 2-qator). Jelga RNK o'lchami belgilarini kiritish har qanday tasma yoki smear hajmini aniqlashga imkon beradi va shuningdek, jelning to'g'ri ishlashini ta'minlash uchun yaxshi nazorat bo'lib xizmat qiladi (1-rasm, 1-bo'lak). Eslatma: Tanlangan Poly(A) namunalari kuchli rRNK diapazonlarini o'z ichiga olmaydi va taxminan 6 kb dan 0,5 kb gacha bo'lgan smear sifatida paydo bo'ladi (mRNKlar populyatsiyasi natijasida va ta'sir qilish vaqti va sharoitlariga qarab), maydoni 1,5 va 2 kb eng qizg'in (bu smear ba'zan umumiy RNK namunalarida ham ko'rinadi).

Shakl 1. Buzilmagan va buzilgan RNK. Ikki mkg degradatsiyaga uchragan umumiy RNK va buzilmagan jami RNK Ambion RNK Millennium Markers™ yonida 1,5% denaturatsiya qiluvchi agaroz jelida ishlatildi. 18S va 28S ribosoma RNK tasmasi buzilmagan RNK namunasida aniq ko'rinadi. Buzilgan RNK quyi molekulyar og'irlikdagi smear sifatida namoyon bo'ladi.

Sezuvchanlik
RNKning yaxlitligini baholash uchun denaturatsiya qiluvchi agaroz jellaridan foydalanishning kamchiliklari vizualizatsiya uchun zarur bo'lgan RNK miqdoridir. Odatda, EtBr bilan ko'rish uchun kamida 200 ng RNKni denaturatsiya qiluvchi agaroz jeliga yuklash kerak. Ba'zi RNK preparatlari, masalan, igna biopsiyalari yoki lazer yordamida olingan mikrodisseksiyalangan namunalar, juda past rentabellikka olib keladi. Bunday hollarda, ifoda profilini yaratish dasturiga o'tishdan oldin yaxlitlikni baholash uchun 200 ng RNKni tejash imkonsiz bo'lishi mumkin. Molekulyar problardan (Eugene, OR) olingan SYBR® Gold va SYBRï Green II RNK gel boʻyoqlari kabi nuklein kislotaning muqobil boʻyoqlari agaroz jellaridagi anʼanaviy EtBr boʻyogʻiga nisbatan sezuvchanlikni sezilarli darajada oshiradi. 300 nm transilluminator (6 x 15 vattli lampochkalar) va maxsus filtr yordamida SYBR Gold bilan 1 ng RNK va SYBRï Green II RNK jeli bilan 2 ng boʻyoq aniqlanishi mumkin, bu esa namunani oldindan olish uchun kamroq foydalanish imkonini beradi. -yaxlitlikni eksperimental baholash.
Shakl 2. Agilent 2100 Bioanalyzer ma'lumotlari. Yuqori sifatli, eukaryotik, umumiy RNK namunasining elektroferogrammasi. 18S va 28S cho'qqilari mos ravishda 39 va 46 soniyalarda aniq ko'rinadi. Bioanalizatorning mikrokanallari elakdan o'tkazuvchi polimer va floresan bo'yoq bilan to'ldirilgan. Namunalar ularning floresansi bilan aniqlanadi va elektroferogrammalarga yoki jelga o'xshash tasvirlarga tarjima qilinadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).
Agaroz gel tahliliga muqobil
Hozirgi vaqtda an'anaviy gel asosidagi tahlilga alternativa mavjud bo'lib, u RNK namunalarining miqdorini sifatni baholash bilan bitta tez va oddiy tahlilda birlashtiradi. Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) RNK namunalarining holati haqida batafsil ma'lumot beruvchi birinchi tijoratda mavjud bo'lgan mikrofluidika asbobidir. RNA 6000 LabChip® (Caliper Technologies korporatsiyasining roʻyxatdan oʻtgan savdo belgisi) bilan muvofiqlashtirilgan holda foydalanilganda, har bir tahlil uchun 1µl 10 ng/µl talab qilinadi. RNK yaxlitligini baholashdan tashqari, ushbu avtomatlashtirilgan tizim namunadagi RNK kontsentratsiyasi va tozaligini (ya'ni, mRNK preparatlaridagi rRNK ifloslanishini) yaxshi baholashni ham ta'minlaydi. Ilgari, RNK namunasining bir qismi konsentratsiya va tozalikni o'lchash uchun (A260 spektrofotometriyasi bo'yicha) va namunaning boshqa qismi butunlikni baholash uchun ishlatiladi. Biroq, LabChip® tizimidan foydalanib, konsentratsiya, yaxlitlik va tozalik bir vaqtning o'zida bitta 5 ng namunada tahlil qilinadi. Ma'lumotlar jelga o'xshash tasvir, elektroferogramma (2-rasm) va jadval shaklida ko'rsatilishi mumkin
Transkriptom tahlili uchun mRNKni boyitish
mRNK hujayradagi umumiy RNKning kichik qismi bo'lganligi sababli, RNK transkriptlarini boyitish namunadagi yuqori sifatli mRNK miqdorini oshirishga yordam beradi. Poli-A boncuklar orqali ijobiy tanlash yoki ribosoma RNKni olib tashlash kabi bir nechta usullar mavjud.
Ribosomal kamayishi transkriptomikaning muhim usuli bo'lib, juda ko'p rRNK turlarini olib tashlash orqali funktsional jihatdan mos kodlashni, shuningdek kodlanmagan transkriptlarni samarali aniqlash imkonini beradi. Butun transkriptoma RNKni ribosomali RNKning kamayishi (rRNKning kamayishi) bilan boyitish gen ekspresyon mikroarraylari, RNK-Seq va boshqa tahlil usullarida foydalanish uchun namunalar tayyorlashda muhim qadamdir. RNKning ifodalanishini tartibga solish va turlari va funktsiyalari ilgari o'ylanganidan ancha murakkabroq va RNKni o'rganish uchun vositalar qiziqish bilan moslashish uchun ishlab chiqilgan


Ribosomal RNKning kamayishi juda ko'p bo'lgan rRNK turlarini olib tashlash orqali funktsional jihatdan tegishli kodlashni, shuningdek kodlanmagan transkriptlarni samarali aniqlashga yordam beradi.

Nima uchun RNK-seq uchun rRNK yo'qoladi?

Ribosomal RNKning kamayishi poli (A) dumli bo'lmagan RNK, oldindan ishlangan RNK, kichik tRNKlar, siRNK, snRNK, mikroRNK, parchalangan mRNK va boshqa tartibga soluvchi RNKlarning nisbiy ko'pligini oshiradi, ularni polyA + tanlash usullari bilan tozalash mumkin emas.

Ribosomal RNKning zondga asoslangan kamayishi RNK-seq natijalarini qanday yaxshilashi mumkin

Eukaryotik hujayralarda ribosoma RNK molekulalari boshqa barcha RNK turlariga qaraganda taxminan 10 baravar ko'p. Transkriptomika uchun aynan shu ribosoma bo'lmagan RNK ketma-ketlashtirilishi kerak. Agar umumiy RNK ketma-ket bo'lsa, RNK ketma-ketligini o'qishning taxminan 90% ribosoma bo'lib, tajribangiz uchun tegishli o'qishlarning atigi ~10% qoldiradi. Agar rRNK 97% kamaygan bo'lsa, tegishli o'qishlar ulushi deyarli 80% gacha oshadi. 99% rRNK yo'qolishiga erishish orqali RNK-seq uchun o'qishlarning taxminan 90% transkriptomga to'g'ri keladi.

RNK-seq yoki mikroarraylar uchun ribosomali RNKni yo'qotish prob texnologiyasi
RiboMinus rRNKni yo'q qilish texnologiyasi poliadenillanish holatidan yoki 5'-qopqoq strukturasi mavjudligidan qat'i nazar, ribosoma RNK molekulalarini (rRNK) tanlab yo'qotish orqali RNK transkriptlarining butun spektrini boyitish uchun mo'ljallangan. RiboMinus rRNKni yo'q qilish usuli eng ko'p bo'lgan ribosoma RNK molekulalarining katta qismini (99,9% gacha) olib tashlashi ko'rsatilgan, bu esa kamroq ko'p bo'lgan transkriptlarni ko'proq so'roq qilish imkonini beradi, bu sizga RNK-seq yoki mikroarray tahlillaringizdan ko'proq foydali ma'lumotlarni beradi.

rRNKning kamayishi qanday ishlaydi?

Ribosomal RNKni bog'lash uchun mo'ljallangan biotinlangan zond oligonukleotidlari umumiy RNK namunasiga qo'shiladi va gibridlanishga ruxsat beriladi. Keyin namunaga streptavidin bilan qoplangan paramagnit boncuklar qo'shiladi va biotin-oligo-rRNK komplekslarini ushlaydi. Keyin magnit qo'llaniladi, bu boncuk bilan tutilgan rRNKni umumiy RNK namunasidan osongina olib tashlash imkonini beradi. Ribosomal RNK bilan yo'qolgan namuna quyi oqimga qarab konsentratsiyalanishi mumkin. Ribominus rRNKni yo'q qilish to'plamlari ribosoma RNKni yo'qotish ish jarayonini soddalashtirish uchun turlarga xos zondlar, Dynabeads streptavidin bilan qoplangan magnit boncuklar va konsentratsiyali spin ustunlarini (ixtiyoriy) bilan ta'minlaydi.



Muvaffaqiyatli rRNKning kamayishi yuqori sifatli umumiy RNK bilan boshlanadi
Transkriptomik tajribalaringiz muvaffaqiyatli bo'lishiga yordam berish uchun boshlang'ich materialingiz sifatli ekanligiga ishonch hosil qiling. Umumiy RNK izolyatsiyasi uchun ushbu echimlarni o'rganing.
Xulosa