Учебное пособие Якупов Т. Р. Молекулярная биотехнология Биоинженерия Казань 2016

4. Методы изучения генома
Секвенирование нуклеиновых кислот.
Секвенирование - определение нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот. Известны различные технологии секвенирования. Технологии ДНК-секвенирования зарождались благодаря работам Уолтера Гилберта и Фредерика Сенгера в 70-х годах прошлого века. С момента возникновения они перевернули человеческое понимание о биологии. В настоящее время секвенирование является важнейшей технологией в установлении функции отдельных генов. В процессе секвенирования генома организма исследователь получает информацию о всей ДНК, находящейся в хромосомах клеток. Эта информация включает количество и последовательности всех генов и некодирующих участков. В основе технологий секвенирования лежат различные стратегии, основанные на уникальных комбинациях приготовления ДНК-матриц, визуализации, а также выравнивания и составления нуклеотидных последовательностей.
Основным преимуществом современных методик секвенирования является рентабельность и экспресность. Существенный прогресс в технологиях за последние годы, в скором времени может привести к уменьшению стоимости секвенирования до 1000 долларов на индивидуальный геном. Биотехнологические компании уже сегодня предлагают индивидуальное секвенирование и генотипирование, а также информацию о персональной родословной. В ближайшем будущем пациенты смогут принести информацию о собственном геноме для того, чтобы врач смог оценить риски заболеваний и скорректировать стратегию лечения.
В настоящее время используют два основных метода – химический и ферментативный методы секвенирования.
Химическое секвенирование основано на избирательном разрушении нуклеотидов. Метод предложен в 1977 г. А.М.Максом и В. Гильбертом. Для секвенирования этим методом вначале получают одноцепочечную молекулу ДНК, один из концов которой метят с помощью радиоизотопа фосфора - ³²Р. Препарат меченый ДНК делят на 4 порции и каждую порцию обрабатывают реагентом, специфически разрушающим азотистые основания. Так добавление 60% муравьиной кислоты разрушает пуриновые основания (аденин и гуанин), добавление диметилсульфата – только гуанидина, гидразин разрушает пиримидиновые основания (тимин и цитозин), под действием 1,5 М NaCl разрушается только цитозиновые основания. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного азотистого основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех пробах, разделяют путем электрофореза в акриламидном геле, затем проводят радиоавтографию и по положению фрагментов, содержащих радиоактивную метку, определяют расстояние от меченого конца где находилось разрушенное основание. Метод Максима - Гельберта имеет ряд недостатков, а именно анализ является длительным и трудоемким.
Среди большого многообразия методик ферментативного секвенирования наиболее известным является метод Сэнгера предложенный в 1977 г. и получивший название метода терминирующих аналогов трифосфатов. Этот способ, несколько модифицированный, и в более мощном, более технологичном варианте применяется до сих пор. В основе метода лежит ферментативное клонирование ДНК, используя в качестве праймеров синтетические олигонуклеотиды.

Рис.9. Схема метода секвенирования по Сэнгеру.
Специфическую терминацию синтеза обеспечивает добавление в реакционную смесь помимо четырех типов нуклеозидтрифосфатов (один из которых радиоактивно мечен) и одного из 2',3'-дидезок-синуклеозидтрифосфатов, который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. В итоге удается получить набор копий ДНК различной длины. Для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК необходимо провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определяется последовательность нуклеотидов (рис.9).
Современные секвенаторы – это так называемые секвенаторы второго поколения (SGS, second generation sequencing). В них участки ДНК также по-прежнему многократно клонируются, но процесс чтения устроен не так, как у Сэнгера. Существует много разных методов, отличающихся довольно существенно.
1) Секвенирование лигированием (sequencing by ligation) - на фазе распознавания нуклеотидов используют не ДНК-полимеразу и процесс репликации, а специальные короткие «зонды», которые присоединяются к комплементарным нуклеотидам, фиксируются, затем вымываются, и процесс повторяется снова.
2) Пиросеквенирование (pyrosequencing) - основано на хемилюминесцентных сигналах, которые подают специально модифицированные нуклеотиды, когда соединяются с комплементарным нуклеотидом в прочитываемой нити ДНК.
3) Метод ионного полупроводникового секвенирования - детектирует соединения (ионы), которые выделяются при присоединении нового нуклеотида к нити ДНК.
Рестрикционный анализ.
Метод основан на способности ферментов рестрикции (рестриктазы) специфически расщеплять ДНК в определённых сайтах. Рестриктазы стали эффективным инструментом исследования нуклеиновых кислот. Они позволяют превращать молекулы ДНК в набор фрагментов длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч оснований. Методом электрофореза в агарозном геле фрагментов ДНК, различающихся по размеру, можно легко разделить, а затем исследовать каждого по отдельности.
При электрофорезе короткие фрагменты мигрируют намного быстрее, чем длинные. При окрашивании гелей красителями, связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых соответствует рестрикционному фрагменту.

Рис.10 Результаты электрофореза после обработки фрагмента ДНК разными рестриктазами.

Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного участка генома набором рестриктаз, позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.
Использование рестриктаз позволили разработать методы получения рекомбинантных молекул, генов, трансгенеза и решения проблем генной инженерии, способствовали разработке эффективных методов секвенирования ДНК.

Полимеразная цепная реакция.