Учебное пособие Якупов Т. Р. Молекулярная биотехнология Биоинженерия Казань 2016

Методы идентификации ГМО.

Разработка методов идентификации ГМО началась одновременно с выходом пищевой продукции из ГМО на мировой продовольственный рынок. В настоящее время подавляющее большинство ГМО растительного происхождения, представленных на рынке, как было сказано выше, отличается от исходного традиционного сорта растения наличием в геноме рекомбинантной ДНК — гена, кодирующего синтез белка, который определяет новый признак, и последовательностей ДНК, регулирующих работу этого гена, а также собственно нового белка. В качестве мишени для определения ГМО в пищевом продукте могут рассматриваться как новый модифицированный белок, так и рекомбинантная ДНК.

Все методы идентификации ГМИ растительного происхождения подразделяют на 3 группы:
- химические;
- иммунологические;
- молекулярно-генетические (методы ПЦР).
Химические методы направлены на определение соединений, которые могут синтезироваться в клетках ГМО в ответ на внедрение чужеродных генов: трансгенная ДНК, новый экспрессированный белок, ферменты, олигосахариды, высокомолекулярные жирные кислоты, витамины, гормоны и др.
Наиболее широко применяются из этой группы методов исследования — методы хроматографии, спектрофотометрии, спектрофлюориметрии и др., которые выявляют измененные параметры в химическом составе продукта. Так, генетически модифицированные линии сои G94-1, G94-19, G168 имеют измененный жирнокислотный состав, сравнительный анализ которого показал увеличение содержания олеиновой кислоты в генетически модифицированной сое (83,8%) по сравнению с ее традиционным аналогом (23,1%). Применение в данном случае метода газовой хроматографии позволяет выявить генетическую модификацию сои даже в таких продуктах, которые не содержат ДНК и белка, например, рафинированное соевое масло.
Присутствие в продукте нового белка дает возможность применять для определения ГМО иммунологические методы. Они наиболее просты в исполнении, имеют относительно низкую стоимость и позволяют определить конкретный белок, несущий новый признак. В настоящее время разработаны тест-системы, применяя которых можно проводить количественное определение модифицированного белка в продуктах. Технологической основой в подобных тест-системах в большинстве случаев используются методы иммуноферментного анализа.
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) был предложен в начале 70-х годов двумя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, Van Weemen и Schuur в Нидерландах. Принцип метода заключается в том, что антиген (АГ) или антитело (АТ), вступающее в иммунную реакцию, метится ферментом и по превращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции АГ – АТ. Чувствительность ИФА чрезвычайно высока и позволяет определять минимальные количества вещества (нанограммы). Методы иммуноферментного анализа основываются на двух принципиальных научных открытиях. Первое заключается в способности иммобилизованных на твердой основе ферментов и антител сохранять свою функциональную активность. Второе - на создании комплекса антитело-фермент (АТ-Ф) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе.
Иммуноферментный анализ, возникший на пересечении иммунохимии и инженерной энзимологии, стал в настоящее время одним из распространенных методов исследования. Явные преимущества этого метода, к которым относятся простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов, обеспечили его прочное положение в клинической биохимии, при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях. Методы иммуноферментного анализа являются весьма перспективными для ранней диагностики возбудителей вирусных и микробных болезней животных и человека, для проведения массовых эпизоотологических и эпидемиологических обследований, для определения в организме минимальных концентраций лекарственных препаратов, токсических веществ и гормонов, для контроля технологии микробиологической промышленности и наблюдения за окружающей средой.
Благодаря успехам биотехнологии иммуноферментный анализ интенсивно развивался, поскольку с помощью генной инженерии были получены в высокоочищенном виде малодоступные антигены, ферменты – маркеры и их конъюгаты с антигенами, а с помощью клеточной инженерии – моноклональные антитела с заданной специфичностью и аффинностью. В настоящее время возникают все новые направления развития иммуноферментных методов анализа связанные, главным образом, с использованием различных методoв регуляции ферментативной активности при детектировании комплексов антиген – антитело.
Одним из недостатков этого метода при идентификации ГМО является низкая эффективность при оценке продуктов, подвергшихся какой-либо технологической обработке, вызывающей практически полную денатурацию или расщепление молекул модифицированного белка. Возможность определения белка иммуноферментным методом может быть ограничена также уровнем его содержания в продукте.
В большинстве стран мира основным способом определения ГМО в продуктах являются молекулярно-генетические методы, основанные на определении рекомбинантной ДНК и главным образом, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК более стабильна, чем белок, и в меньшей степени разрушается при технологической или кулинарной обработке пищевых продуктов, что делает возможным определение в них ГМО. Объединенный Научный Центр Европейской Комиссии объявил этот метод в качестве стандартного для идентификации ГМО.
В России ПЦР был утвержден Минздравом РФ в качестве основного метода для идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в пищевых продуктах в 2000году.
В 2003 году утвержден и введен в действие постановлением Госстандарта России ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации ГМО растительного происхождения», который утвердил этот метод для определения ГМ в пищевых продуктах.
Одновременно был утвержден национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52174-2003 «Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа».