Viruslar uchun gemagglyutinatsiyani to‘xtatish reaksiyasi (gatr) yordamida antitelolarni titrlash

Reaksiya-ning komponentlari	Tajriba
Nazorat
Zardobni suyultirish								zar-dob-lar		Erit-rotsitlar		Virusning GAB
1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256					2		1		½		¼
Fiziologik eritma, ml	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2		0,2		0,4		0,4		0,4		0,4		0,4
Zardob, ml	0,2	0,2 ml dan ketma-ket o‘tkazish*							-		-		-		-		-		-
Virus T=4GAB, ml	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2		-		-		0,4		0,4 dan o‘t-kazish**
Virus bi-lan zar-dobni qo‘shish (kontakt)	Xona haroratida 40-60 daqiqa qoldiriladi
1% eritro-tsitlar	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4		0,4		0,4		0,4		0,4		0,4		0,4
Saqlab tu-rish (eks-pozitsiya)	Xona haroratida 40-60 daqiqa qoldiriladi
Natija	-	-	-	-	-	++	+++	+++		-		-		+++		++		-		-

*oxirgi probirkadan 0,2 ml chiqarib tashlanadi.
** oxirgi probirkadan 0,4 ml chiqarib tashlanadi.


Demak, har bir probirkaga virusning hajmida va zardobning hajmiga teng eritrotsitlarning 1% suspenziyasidan qo‘shilganda bu yerdagi virionlarning soni eritrotsitlarni 100% agglyutinatsiyaga uchratishga qodir (virusning 1 GAB 1% suspenziyadagi eritro-tsitlarni 50% agglyutinatsiyalashini esga olamiz). Agar virusni 4 GAB dan kam olsak, gemagglyutinatsiya hodisasi sodir bo‘lmasligi virionlarning soni u yoki bu texnik xato va kamchilik sabablariga ko‘ra to‘satdan kamayishi ko‘zda tutiladi va natijada eritrotsitlarni 50% agglyutinatsiyalash qobiliyati kamayishi mumkin (demak, ikki krestga baholangan aniq agglyutinatsiya ham sodir bo‘lmasligi mumkin).
Bu holni sodir bo‘lmasligi uchun probirkaga 1% eritrotsitlar suspenziyasi virus qancha hajmda bo‘lsa, shu hajmda teng quyiladi (yoki probirkadagi suyuqlik hajmining yarmiga teng) yoki virusning titrini 8 GAB ko‘tariladi. Ikki holda ham bir probirkadagi virus miqdori minimumiga 4 marta oshadi va gemagulyutinatsiya usuli bilan aniqlanadi. Ammo antitelo titrining ko‘rsatgichi 2 marta kam bo‘ladi.
Ko‘rsatilgan bu usul, ko‘pincha, antiteloning aniq titrini aniqlash ahamiyatsiz bo‘lgan paytlarda qo‘llaniladi. GATR ning modifikatsiyasi 9 jadvalda ko‘rsatilgan
9-jadval. Eritrotsitlarning ikki marta kamaytirilgan miqdorining GATR dagi sxemasi

Reaksiya-ning komponentlari	Tajriba								Nazorat
	Zardobni suyultirish								Zar-dob-lar	Erit-rotsitlar
	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256			2	1	1/2	1/4
Fiziologik eritma, ml	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,4	0,2	0,2	0,2	0,2
Zardob, ml	0,2	0,2 ml dan ketma-ket o‘tkazish							0,2	-	-	-	-	-
Virus T=4GAB, ml	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	-	-	0,2	0,2 mldan o‘tkazgich
Virus bi-lan zar-dobni qo‘shish (kontakt)	Xona haroratida 40-60 daqiqa qoldiriladi
1% eritro-tsitlar	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Saqlab tu-rish (eks-pozitsiya)	Xona haroratida 30-40 daqiqa qoldiriladi
natija	-	-	-	-	++	+++	+++	+++	-	-	+++	++	-	-

Antiteloning titrini to‘g‘ri aniqlashda zardobning suyultirilgan darajasi ham ta’sir qiladi. Suyultirish darajasi qancha kichik bo‘lsa, antiteloning titri shuncha to‘g‘riroq aniqlanadi, lekin juda kichik suyultirish darajalarini tayyorlash noqulay bo‘lganligi sababli odatda ikki karrali suyultirilgani qo‘llaniladi.
Zardobdagi antiteloning titrini juda to‘g‘ri aniqlash kerak bo‘lgan paytda reaksiyada olingan virusning miqdori 4GAB titri nazoratda kam bo‘lgan payti, antiteloning titrini o‘zgartirishning iloji bor. Agar nazoratdagi 3-probirkada virusning titri 1\2 GAB 2-3 krestga teng gemagglyutinatsiya va 4 da esa manfiy natija bo‘lsa, bu esa reaksiyaga 4 GAB o‘rniga 8 GAB virus olinganidan dalolat beradi. Shu sababli tekshiriladigan zardobdagi antiteloning haqiqiy titri olganimizdagidan ikki marotaba yuqori bo‘ladi. Agar virusning titrini 4 GAB olinganda (8 GAB emas) uning gemagglyutinatsiyalovchi aktivligini neytrallash uchun 2 marta kam antitelo talab qilinar edi va zardobning gemagglyutinatsiyani to‘xtatuvchi oxirgi suyultirilgani 2 marta ko‘p bo‘lar edi.
Aksincha, agar virusning 1 GAB nazoratida (2-probirka) gemagglyutinatsiya sodir bo‘lmasa, unda zardobdagi antiteloning titri 2 marta ko‘pligidan dalolat beradi.
Hamma vaqt GATR tekshiriladigan zardoblarni virusga qarshi termostabil spetsifik bo‘lmagan ingibitorlardan xalos qilishni nazarda tutish kerak, chunki ular ham virusning gemagglyutinatsiyalovchi qobiliyatini to‘xtatish xususiyatiga ega.
Shu maqsadda zardoblarga quyidagi moddalarning biri bilan ishlov beriladi; karbonat angidrid gazi (CO₂), kaliy periodat (KlO₄), rivanol, kaolin, aktivlashtirilgan ko‘mir, xolera vibrionining ekstrakti va hokozolar. Virusning termostabil spetsifik bo‘lmagan ingibitorlaridan zardobni ozod qilishning eng oddiy usuli CO₂ yordamida ishlov berish hisoblanadi. Buning uchun dastlab zardob distillangan suv bilan 1:10 suyultiriladi gaz pufak hosil bo‘lib 3-5 daqiqa davomida zardob loyqalanguncha (ballon yoki Kipp apparatidan foydalanib) CO₂ gazi o‘tkaziladi.
So‘ngra zardob 10-20 daqiqa davomida 2000-2500 ayl/daqiqa davomida sentrifugalanadi, cho‘kma usti suyuqligi olinadi (ingibitorlar cho‘kmaga tushadi).
Zardobning izotonikligini tiklash uchun 8,5% natriy xlor eritmasidan uning 0,1 hajmda suv bilan suyultirilganiga teng hajmda quyiladi. CO₂ bilan ishlov berilgan zardoblarni ishlatganimizda 1:11 darajagacha suyultirilganini yodda saqlash kerak.

Topshiriq

Quyonning qon zardobida n’yukasl kasalligiga qarshi antiteloning titrini GATR yordamida aniqlash.
Material bilan ta’minlash:
Titri aniq bo‘lgan n’yukasl kasalligining virusi (oldingi mashg‘ulotdan); n’yukasl kasalligiga qarshi immunlangan CO₂ bilan ishlov berilgan quyonning qon zardobi; fiziologik eritma NaCl; 1% yuvilgan xo‘roz eritrotsitlarining suspenziyasi; pleksiglas panellar; 1 ml belgilangan pipetkalar; rezina noklar; Kipp apparati.
Mashg‘ulotning taxminiy rejasi (2 soat)
1.GATR qo‘yish jadvaliga binoan (o‘tgan mashg‘ulotdan) talabalarning mustaqil ishi: a)Zardobning ikki karalli suyultirilganini tayyorlash (0,2ml); b)virusni 4 GAB titrini qo‘shish (0,2 ml); s)virus bilan zardobni 40-60 daqiqagacha qo‘shib turish.
2.O‘qituvchining nazorat savollari va tushuntirishi (qo‘shish vaqtida)
3.Zardoblarni viruslarning spetsifik bo‘lmagan ingibitorlaridan tozalash yo‘llarini ko‘rsatish.
4.Talabalarning mustaqil ishini davom etkazish: a)eritrotsitlar suspenziyasini quyish; b)30-40 daqiqa saqlab turish (ekspozitsiya)
5. Ekspozitsiya vaqtida o‘qituvchining tushuntirishi.
6. Antiteloni titrashdagi GATR ning natijalarini hisoblash.
7. Savollarga javob berish.


Nazorat uchun savollar:
1.Antigenlar va antitelolar nima?
2.Serologik reaksiya nima va qaysi maqsadda ishlatiladi?
3.GATR qo‘llashdagi asosiy tartib qoidalar nimalardan iborat?
4.GATRning modifikatsiyasini aytib bering?