Ўзбекистон республикаси олий ва ўрта махсус таълим вазирлиги тошкент кимё технология институти биотехнология кафедраси

Тамакининг стерил ўсимлиги баргидан протопластлар ажратиш.
«Протопласт» деганда фаол метаболизм ва энергия алмашиш қобилиятига эга бўлган, хужайра қобиғи ичида жойлашган, хужайрани бир қисмини тушуниш мумкин. Протопластларни ажратиб олиш усуллари ривожланган сари тадқиқотчилар протопластлар деб микроб хужайраси парчаланганда ҳосил бўладиган ярим ўтказгич хусусиятига эга бўлган цитоплазма мембранасини атайдиган бўлдилар. Узоқ вақтларгача протопластлар асосан цитологик изланишнинг манбаи сифатида қаралар эди. Ҳозирги пайтда протопластлар ёрдамида олинган микроорганизмларни қимматли дурагай штаммларини саноат миқёсида кенг қўлланилмоқда. Протопластларни қўшиш усули, микроорганизмларни генетик селекцион жараёнларини атрофлича ўрганиб, хужайралардан нормал жинсий усул билан дурагай олиш мумкин бўлмаганда, протопластлар ёрдамида турлараро дурагай олиш мумкинлигини тақоза қилади.
Протопласт олиш усуллари асосан 3 туркумга бўлинади.

1. 
   Механик усул;
   
2. 
   Ҳужайра деворларидаги компонентларни специфик синтези;
   
3. 
   Литик ферментлар таъсирида ҳужайра деворларини парчалаш.
   

Механик усул билан протопласт олиш асосан кам самарали бўлгани учун деярли қўлланилмайди.
Ҳужайра деворларидаги компонетларни специфик синтези эса специфик ингибитрларни танлаб ҳужайра деворига таъсир қилиб цитоплазматик компонентларга зарар етказмайди.
Протопластларни бактерия ҳужайраларидан литик ферментлар ёрдамида ажратиб олишда ҳар-хил литик ферментлардан асосан лизоцимдан фойдаланилади.Хозирги пайтда бир қатор микроорганизлардан литик ферментлар ажратиб олиш йўлга қўйилган. Булар жумласига Streptomeces, Arthrobactrer luteus, Bacillus circulans, Trichoderma harzianum, Actinomycesлар киради.
Ишнинг бориши Стерил ўсимлик Петри ликобчасига солинади. Скальпел ёрдамида барглар ажратилади ва барг четидан марказий томирлар томон эни 5 мм ли бўлакчалар кесилади. Кенг оғизли 100 мл колбадаги шиша фильтр ёки «Миллипор» типидаги 20 мл фильтрдан ўтказилган ферментли эритмага барглар солинади. Эритмадаги барглар 27^оС да 12-15 соат ёки 2-4 соат тебратгичда (80 теб/дақ) инкубация қилинади. Барглар инкубацияси зич озуқа мухит билан биргаликда нейлон тўр (тешигининг ўлчами 60 мкм) дан ўтказилади. Аралашма центрифуга пробиркаларига солиниб, тенглаштирилади ва 10 дақиқа 80-100 айл/дақда центрифугаланади. Протопластлар халқаси пастер пипеткаси ёрдамида йиғилиб, ювиш учун тайёрланган аралашма солинган центрифуга пробиркаларига ўтказилади ва яна центрифугаланади. Бу процедура уч марта такрорланади. Протопластлар янги озуқа мухитида 1-2х10⁵ хуж/мл зичликда ресуспендирланади. Икки хисса агар (1,2%) тутувчи озуқа мухити ( 1 жадвал) эритилади, 45^оС гача совутилади ва тенг миқдордаги протопластлар суспензияси билан аралаштирилади. Аралашма 3-6 см диаметрли Петри ликобчаларига солиниб, парафилм билан елимланади ва термостат хонага қўйилади. 3-4 хафтадан сўнг ўлчами 1 мм дан катта бўлган колониялар сони саналади. Колониялар янги озуқа мухитига қайта ўтқазилади.
12-жадвал

Тамаки протопластлари ажратиш учун ферментли аралашма, 20 мл/мг аралашмада	ишда фойдаланиладиган тузлар таркиби250 мл / мг тузлар.
Driselasa 67 Cellulsin 40 Macerozume 4,5 Сахароза 35,5 Глицин 150 CaCl2 8 MES 20 РН 5,5-5,7	NaCl 2,25 KCl 0,2 CaCl 3,4 Глюкоза 0,25 РН 5,6