Аффин хромотографияси

2.3. Аффин эюгерлаш
Аффин xромотографиясининг усули бу ажралаётган модданинг макромолекуласи аффин лиганд билан специфик комплекс ҳосил қилишига асосланган, носпецифик сорбентдан биоспецифик элюгерлаш ҳисобланади. Ушбу усул аффин элюгерлаш ва баъзи ҳолларда “субстрат билан номи билан специфик элюгерлаш” номи билан маълумдир[54]. Усул асосида носпецифик боғланиш ётади. Масалан, полимер билан ферментлар аралашмаси ўзида функционал гурухларни тутиб ферментлар билан ўзаро таъсирлашади. Кейинчалик талаб этиладиган фермент субстрат ингибитор ёки бошқа аффин лиганд эритмаси билан элюгерланади.
Аффин элюгерлаш усулида энг кўп қўлланиладиган полимерлар бу ионалмашинувчилардир. Агарда сорбцияланувчи молекула ферментнинг боғловчи қисмида жойлашган гурухлар ёрдамида боғланса, у ҳолда хар қандай ион алмашинувчи “умумий лигандлар” тутувчи аффин полимер сифатида кўриб чиқилиши мумкин.
Қачонки эркин аффин лиганд билан оқсил комплекси ҳосил бўлса, унинг боғловчи марказидаги зарядланган гурухлар, ион алмашинувчи билан ўзаро таъсирдан химояланган бўлиб қолади. Ушбу химоя стерик омиллар билан шартланган бўлиб, ёки энг яxши ҳолатларда аффин лиганддаги қарама-қарши зарядлар билан нейтралланиши мумкин. Агарда ферментдаги ва бошқа фермент аффин лиганд комплексидаги зарядланган гурухларнинг эркинлик даражасидаги фарқлар катта бўлса, у ҳолда фермент фермент-аффин-лиганд боғланмайдиган шароитларида боғланади (pH ва ион кучи). Фермент зарядини ўзгартирилиши керак даражасини олдиндан аниқлаш қийин, бу ўз уни сорбентдаги боғланиши олдини олишга ёрдам беради. Модомики, элюгерлаш учун энг самарали аффин лигандлар ионалмашинувчи зарядига ўxшаш бўлган зарядланган гурухларни тутганлари ҳисобланса, у ҳолда десорбция эркин ферментдаги умумий зарядлар ва фермент аффин лиганд комплексидаги заряднинг фарқи билан шартланган деган таxмин илгари сурилган. Бироқ назарий жихатдан нейтрал лигандлар ҳам ферментни десорбциясига олиб келиши мумкин, агарда десорбцияга жавобгар зарядланган гурухлар аффин лигандни боғловчи сохада жойлашган бўлса ва комплекс ҳосил бўлгандан сўнг ионалмашинувчи билан ўзаро таъсирлашишидан стерик химояланади ёки ион алмашинувчининг зарядланган гурухлари билан ўзаро таъсирини олдини олувчи конфермацион ўзгаришлар рўй беради[54,55].
Фермент ва фермент-субстрат комплексидаги зарядлар ўртасида фарқ билан бир қаторда элюгерлаш самарасига яна ион алмашинувчи ва фермент алоқа ҳамда ферментни аффин лигандга ўxшашлиги ҳам таъсир этади. IE ион алмашинувчи билан боғланган ферметн E нинг [(7.1)тенгламаси] ва эритмадаги α лиганди билан боғланган фермент орасида ўзаро бoғлиқ мувозанат мавжуддир. [(7.2)тенглама]

K=[E∙ IE] (7.1)

[E][IE]

K₂= [EL] (7.2)

[E][L]

[EL]=K₂[L][E∙ IE] (7.3)

K₁[IE]

Бу ҳолада ион алмашинувчи охирги сондаги боғловчи сохаларни тутувчи макромолекула сифатида қаралади. Ушбу тахмин маълум шароитлар, айнан pH, ион кучи ва полимер билан боғланувчи ферментнинг маълум миқдоридагина тўғри ҳисобланади.

Модомики, элюгерланаётган мухитнинг ион кучи ошиши билан К₁ узлуксиз равишда камайиб борар экан, у ҳолда хар қандай тизим учун назарий жихатдан фермент-аффин лиганд комплекси ҳосил бўлиши учун шароитларни топиш мумкин. Бироқ амалда элюатда аралашган оқслларнинг миқдори кам бўлиши учун, эритманинг ион кучини паст даражада ушлаб турилиши керак(7.3) тенглама ва (7.1) ва (7.2) тенгламалардаги эркин ферментнинг концентрацияси тенг деган тахмин асосида чиқарилган. Хақиқатда бу ҳолат самарали элюгерлаш учун энг охирги ходиса ҳисобланади. (7.2) тенгламдаги [Е] дан ошмаслиги керак, акс ҳолда фермент полимер билан боғланган ҳолатда қоларди.
Берилган ферментни тозалаш одатда фермент-аффин лиганд комплексининг ўзаро таъсири спецификлиги билан белгиланади. Агарда бир нечта комплекслар ҳосил бўлса, масалан E₁L ёки E₂L, у ҳолда ферметн элюгерлашнинг тартибини аниқлаш қийин, чунки амалда К₁ қийматини топиш қийин. Агарда фермент E₁ нинг полимер билан ассоциацияси константаси К₁, фермент E₂ билан полимернинг ассоцация константаси К₁² деб тахмин қилинса , у ҳолда бу қийматларнинг сезиларли фарқларида туз градиентидаги оддий xроматография билан осон ажратиш мумкин. Уларнинг тахминий мувозанатда иккала фермент ҳам бир вақтнинг ўзида элюгерланади, aгарда К¹₂>К₂ бўлса, у ҳолда E₁ биринчи элюгерланди. Масалан, умумий лиганд сифатида NAD+ ни тутувчи аффин полимердаги сорбция жараёнида, элюент сифатида 0,15мМ NAD+[31] қўллаган ҳолда глицералъдегидфосфатдигедрогеназани (К_мNAD=5•10-5 моль/л) лактатдигидрогенозадан (К_мNAD=1•10-4 моль/л) ажратиб олиш мумкин. Бу ҳолда К₂¹ ½ К²₂ га тенг.
Биоспецифик элюгерлашни қўллашга типик мисол сифатида аминоацил-тРНК-синтезтазаларни ажратишни кўрсатиш мумкин[53]. Ушбу ферментлар учта турли хил зарядланган ферментлар билан таъсирлашади- тРНК, АТР ва аминокислоталар билан. Аминокислоталар ионалмашинувчилардан синтетазаларни элюгерлашга мос келмайди. Чунки нейтрал pHда улар цваттер ионлар ҳолатида бўлиб, ўзлари адсорбцияланади. Натижада 2-аминоетанолсинтетаза серин тРНК-синтетазани, фенилэтиламин-фенилаланин тРНК-синтетазани ва тиамин-тирозин тРНК-синтетазани элюгерлашда қўллашади. Ушбу аминлар мувофиқ келувчи аминокислоталар билан аминоациялаш реакцияларининг рақобатли ингибитири ҳисобланади.