Академии наук т. П. Побежимова, А. В. Колесниченко, О. И. Грабельных

Определение чистоты и качества полученного препарата 
митохондрий. Определение чистоты и качества полученной 
фракции митохондрий можно проводить различными путями: 1) по 
величинам дыхательного контроля по Чансу – Вилльямсу (ДК) и 
отношения АДФ/О; 2) путем определения ферментативной 
активности фракции (по наличию активности ферментов-маркеров 
митохондрий и отсутствию активности ферментов-маркеров, 
свидетельствующих о наличии немитохондриальных компонентов); 
3) 
путем электронномикроскопического исследования. Об 
интактности митохондрий чаще всего судят по проницаемости 
наружной мембраны для цитохрома с и отсутствию активности 
ферментов матрикса, таких как малатдегидрогеназа и фумараза. 
Определение 
активности 
цитохром 
с 
оксидазы. 
Активность цитохром с оксидазы (ЕС 1.9.3.1) измеряют при 
комнатной 
температуре (Tolbert, 1974) по 
окислению 
восстановленного цитохрома с при 550 нм в среде, содержащей 0,3 
М сахарозу, 10 мМ КН
2
РО
4
(рН 7,2), 10 мМ KCl, 50 мкМ цитохрома 
с (предварительно восстановленного гидросульфатом натрия), 0,2% 
Тритон Х-100 и 100-150 мкг митохондриальной фракции. 
Активность цитохром с оксидазы рассчитывают по формуле 
(Wharton, Tzagoloff, 1967): 
Е
t1
с 
А = 2,3 log ---- х ----------- , где 
Е
t2
∆t W 

---

18 
Рис. 6. Схема получения субмитохондриальных фракций (по 
Guillot-Salomon et al., 1997; Побежимова и др., 
2001). 

---

19 
Где: 
А- активность фермента, выраженная в мкм/мин/мг белка; 
Е
t1
-начальная оптическая плотность; 
Е
t2
-оптическая плотность через определенное время; 
∆t- время, мин; 
с- концентрация цитохрома с, мкМ; 
W- количество белка, мг. 
Целостность наружной мембраны митохондрий определяют 
последовательными измерениями активности цитохром с оксидазы 
в отсутствии и присутствии 0,2% Тритона Х-100. Содержание белка 
в различных фракциях митохондрий определяют по методу Лоури 
(Lowry et al., 1951).