Amaliy mashg’ulotlar materiallari amaliy mashg`ulot №1. Oqsil molekulasining aminikislota tarkibini aniqlash usullari

Amaliy mashg`ulot №5.
Zamonaviy spektrofotometrik usullar yordamida oqsil va peptidlarni tuzilishini o`rganish usullari
Fotokolorimetrik usulda tahlil qilishda tekshirilayotgan eritma rangining ravshanlik darajasi (kontsentratsiyasi) avvaldan ma`lum bo`lgan standart eritma rangi bilan solishtiriladi. Kolorimetrik aniqlashda miqdori o`lchanayotgan moddaning boshqa modda bilan rangli birikma hosil qilish reaktsiyasidan foydalaniladi. Olingan eritma rangini jadalligi bo`yalgan moddaning miqdoriga to`g`ri proportsional. Rang jadalligi qanchalik ko`p bo`lsa, optik zichlik ham shunchalik yuqori bo`ladi. Grafik bog`liqlikni aniqlashda abtsissa o`qiga mol'/l (S) da modda miqdori, ordinata o`qiga esa eritmaning optik zichligi (D) qo`yiladi. Uslubni qo`llash uchun D va S ko`rsatkichlari o`rtasida proportsional bog`liqlik bo`lishi shart.
Spektrofotometrik tahlil usulida eritmadagi yoki qattiq muhitdagi moddaning nur yutishi ma`lum to`lqin uzunligiga to`g`ri kelishi aniqlanadi. Spektrofotometrni qo`llab spektrni ko`zga ko`rinadigan (600 dan 1100 nm), ultrabinafsha spektr qismida (220 dan 650 nm gacha) ishlash mumkin.
Biologik birikmalarning tuzilishi, almashinuvi va vazifalarini o`rganish uchun kimyo, fizik-kimyo, matematika, fiziologiya usullari bilan bir qatorda biologik kimyoning o`zining xususiy tadqiqot usuli – fermentativ tahlil usuli ham bor. Bu usul amaliy tibbiyotda, farmasiya va ilm-fanning turli sohalarida hamda xalq xo`jaligida keng qo`llaniladi.
Oksillarning gomogen xolda ajratib olish ularning birlamchi, ikkilamchi, uchlamchi va turtlamchi strukturasining urganishiga imkoniyat tugdiradi. Oksilning aminokislota tarkibini aniklash uchun oksili tula aminokislotalarga gidroliz kilinadi va analizatorlar yordamida aminokislotalarida tekshiriladi.
Oksilning ikkilamchi strukturasini esa izotop almashinish usuli, ulьtrabinafsha va infrakizil spektroskopi usullari yordamida aniklanadi. Bu usullar polipetid zanjirini spirallanish darajasini aniklashda imkoniyat beradi. Oksilning uchlamchi va turtlamchi strukturasi - elektron mikroskop va rengenostruktura analizi yordamida aniklanadi.
Glyukoza va boshka uglevodlarni fermentativ aniklash usullari spetsifik fermentlardan foydalanishga asoslangandir. Glyukozani aniklash uchun kuyidagi fermentlardan foydalaniladi:
a) glyukozoksidaza, glyukozani glyukon kislotasi va N₂O₂ gacha oksidlaydi
b) geksokinaza, ushbu reaktsiyani katalizlaydi
glyukoza+ATF ----- glyukoza-6-fosfat
v) glyukozadegidrogenaza. Glyukozani NAD yordamida glyukozolaktongacha oksidlaydi.
Keng tarkalgan ferment usuli bulib glyukozani biomateriallarda glyukozoksidaza yordamida aniklash xisoblanadi. Glyukozaning mikdori xakida eritmada kislorod kontsentratsiyasining kamayishi yoki xosil bulgan N₂O₂ mikdori buyicha fikr yuritiladi.
Etanolning mikdorini aniklash alkogoloksidaza yoki alkogoldegidrogenazadan foydalanishga asoslangan. Alkogoloksidaza etanolning xavo kislorodi bilan atsetalьdegidegid va N₂O₂ gacha oksidlanishini katalizlaydi_.
Alkogolьdegidrogenaza etanolni alьdegid va NADN₂ gacha oksidlaydi.
Keyingi yillarda etanolni aniklashning fermentativ elektrod usuli yaratilgan.
Siydikchilni aniklash ureaza fermenti yordamida uning NN₄⁺ va SO₂ ga parchalanishiga asoslangan_. Ureaza eritmalaridan analizatorlarda foydalaniladi, xosil bњlgan NN₄⁺ ishkor ta’sirida gazsimon ammiakka aylanadi va u NN₃ ni sezuvchi elektrod yordamida aniklaniladi. SHuningdek fermentni membranali elektrodlardan xam foydalaniladi, ularda ureaza eritmasi dializ plenklari orasiga joylashtiriladi.
Siydikchilni aniklash uchun ikki fermentli sistemadan xam foydalaniladi (ureaza-glutamatdegidrogenaza) va mikdoriy aniklash spektrofotometrda NADN₂ ni aniklashga asoslangan.
Siydik kislotani fermentativ aniklash uning kislorod bilan allontoin va N₂O₂ gacha urikaza ishtirokida oksidlanishiga asoslangan.
Tegikli shishaga immobillangan urikaza okar mikroreaktorlarda ishlatiladi.
Aminokislotalarni aniklash L-aminooksidaza fermentlaridan foydalanishga asoslangan, ular aminokislotalarni xavo kislorodi yordamida ketokislota, N₂O_2. va NN₃gacha oksidlaydi, ular elektroximiya usulda aniklaniladi.
Xozirgi vaљtda laktat, piruvat, 3-oksibutiratlarni NADN₂ kontsentratsiyasining uzgarishiga karab spektrofotometr yoki elektroximiyaviy aniklash usuli ishlab chikilgan.
Glitserinni aniklash uchun glitserinkinaza, glitserin-3-fosfatdegidrogenaza usullari kullaniladi. Lipid va fosfolipidlarni aniklash uchun birinchi boskichda spetsifik lipaza va fosfolipaza fermentlaridan foydalaniladi.
Xolinfosfatidlarni spetsifik aniklash usuli xolinoksidaza fermentini kullashga asoslangan, u yordamida xolin betain va N₂O₂ ga parchalanadi. Vodorod peroksidi peroksidaza usuli bilan aniklanadi.
Xolesterinni fermentativ aniklash usullari xolesterinoksidazadan foydalanishga asoslangan, u xolesterinnni xolestan-4-on-3 va N₂O₂gacha oksidlaydi. Oxirgi maxsulot polyarografik, spetrofotometrik, fluorometrik, xemilyuminestsent usulida aniklaniladi.
Fermentlar xolesierinni aniklaganda usulning sezuvchanligi va spetsifikligini oshiradi, shuningdek tekshiruv utkazishni soddalashtiradi.
Spetsifik degidrogenaza va diaforaza kon plazmasida 1mkmolgacha ut kislotalarini fluorometrik indikatsiya kilishga imkon beradi.
Ferment usullari NAD, NADF, FMN va ATF mikdorini aniklashga imkon beradi. NAD mikdorini aniklash uchun laktatdegidrogenaza fermenti kullaniladi.
Bakterialь ferment lyutsiferaza NAD, FMN, ATF mikdorini aniklash uchun foydalaniladi. Guaninnukleotidlarni fermentativ aniklash spetsifik nukleotidkinazalar yordamida utkaziladi, oxirgi maxsulot NADF yoki ATF mikdori aniklaniladi.