Антропогенетика: цитогенетический, биохимический и иммуногенетический методы в изучении наследственности человека

Цитогенетический метод
В изучении генетики человека широко используется цитогенетический метод. Потому что невозможно диагностировать наследственные заболевания без этого метода. Этот метод основан на изучении здоровых и патологических хромосом человека. В 1892 году Флеминг, изучая митоз клеток роговицы, во время метафазы он заметил 22-28 хроматинов. В дальнейшем Г. Винивартер (1912) обнаружил, что в клетках сперматогоний 47, в клетках овогоний 48 хромосом. Год спустя Г. Винивартер и Т. Пайнтер показали присутствие 48 хромосом в женских и мужских диплоидных клетках. Из-за малого размера хромосом, их большого количества и непонятного для того времени механизма распределения хромосом во время метафазы долгое время не было определено точное количество хромосом у человека. После того, как Т.Морган показал наличие наследственных признаков в хромосомах, хромосомы стали широко изучаться вновь. В 1956 году шведские ученые Дж. Тито и А. Леван после искусственного выделения клеток ткани легкого человеческого эмбриона, определили в них наличие 46 хромосом. В этом же году в Англии Ч. Форд и Дж.Хаммертон определили, что в сперматогониях человека 46 хромосом. В дальнейшем было определено, что в норме в диплоидных клетках человека находится 46 хромосом. В настоящее время для изучения хромосом человека широко используются клетки лимфоцитов так, как их можно выделить без вреда для организма. В каждом мл крови имеется 1–3 *10^6 клеток лимфоцитов. В крови лимфоциты находятся в фазе GI или GO интерфазы митоза и в нормальных условиях не делятся. Но в лабораторных условиях можно вызвать искусственный митоз лимфоцитов и получить большое количество клеток. Смотря на взятое количество крови, для приготовления препаратов из хромосом пользуются макро- и микрометодами. Если для выращивания берут 5–10 мл крови—макро, 0,5 мл крови—микро метод. Для искусственного выращивания лимфоцитов пользуются методом, предложенным Мурхедом (1960) и Хангерфордом (1965). По этому методу с помощью стерильного шприца берется 5–10 мл крови из локтевой вены, помещается в центрифугу и добавляется несколько капель гепарина. После 1–2 часов в пробирке осаждаются эритроциты. Затем с помощью пипетки выделяется сыворотка с лейкоцитами, добавляются питательные вещества и фитогемаглюцин(ФГА)- вещество ускоряющее митоз лимфоцитов. Пробирку с лимфоцитами помещают в термостат на 37 градусов на 72 часа, в это время лимфоциты активно делятся, и их количество увеличивается. За 3 часа до конца процесса митоза лимфоцитов доставляется колхицин- вещество останавливающее деление на стадии метафазы. Колхицин препятствует образованию ахроматиновых нитеи, из-за чего хромосомы остаются в центре клетки, не отходя к полюсам, то есть продлевается метафаза. Во время метафазы ясно видна форма хромосом. Пробирка с лимфоцитами и добавленным к ним колхицином помещается в центрифугу, вращающуюся 1000 раз, на 5 минут. После этого появляется осадок. Жидкость над осадком осторожно удаляется. Затем в комнатной температуре пробирку добавляется гипотонический раствор (0,5% раствор калий хлора) и оставляется на 6–10 минут. В гипотоническом растворе клеточная оболочка разрушается, и получается “россыпь” хромосом. Пробирка опять помещается в центрифуги, а гипотонический раствор отливается. В пробирку помещается фиксатор, который останавливает деление лимфоцитов, и структура клеток сохраняется в хорошем состоянии. Обычно, в качестве фиксатора используется этиловый спирт или уксусная кислота (3:1). Смешивается фиксатор с раствором лимфоцитов, затем берется пипеткой одна капля этого раствора и помещается на предметное стекло, сушится. Для выявления ядра пользуются красителями, после препарат опять сушится и исследуется. При помощи малого объектива микроскопа изучаются метафазные хромосомы, их расположение. Если хромосомы располагаются отдельно друг от друга, то такой препарат годен для изучения. Они изучаются с помощью иммерсионного объектива микроскопа. Обычно, для получения информации о хромосомах человека, изучаются более 50 хромосом в клетках. Затем эти хромосомы фотографируются, и определяется их количество, длина, форма и др. Метафазные хромосомы бывают двухроматидными. Эти хроматиды соединяются между собой с помощью центромеры. Центромеры плохо окрашиваются так, как ДНК раскручена, а белка много. Поэтому можно с легкостью обнаружить центромеру. Они сложно устроены, к ним прикрепляются ахроматиновые нити.
Для изучения хромосом человека ученые использовали много различных методов, что усложняло задачу. Нужно было создать единый международный метод изучения хромосом. С этой целью в 1960 году в Америке в Динвере состоялось собрание ученых, на котором была создана единая международная система изучения хромосом человека. В дальнейшем в Лондоне (1963) и Париже (1971) были проведены международные конференции, на которых было решено ввести некоторые поправки в Денверскую систему, в настоящее время эта система широко используется. Согласно этой системе 22 хромосомы одинаковые у мужчин и женщин, а хромосомы, которыми они отличаются- гетеросомы обозначаются буквами X и У. При составлении кариотипа хромосомы располагают по длине от длинных к коротким. Патау (I960) по длине хромосом разделил их на 7 групп, начиная от А до G (рис. 188). Самыми крупными хромосомами являются первые три пары хромосом, из них I и 3 являются метацентрическими, вторая пара субметацентрическими, первые две пары имеют вторичную перетяжку. Морфологически их сложно различить друг от друга. Группа -С (Х6-12). Хромосомы среднего размера. Эту группу хромосом условно можно разделить па 2 подгруппы. В первую подгруппу входят 6,7, X 8 и II субметацентрические хромосомы; у 6 хромосомы посередине малого плеча, а у 8 и 11 хромосом во вторичном поясе рядом с центромерой большого плеча. А во вторую подгруппу входят 9, 10, и 12-ые хромосомы.По расположению центромер эти хромосомы распологаются между субметацентрическими и акроцентрическими хромосомами. Группа -Д (13–15) Акроцентрические хромосомы средних размеров. По морфологическим свойствам эти хромосомы отличить очень сложно. Все 3 являются спутниковыми хромосомами. Группа -Е (16–18). Мелкие хромосомы значительно отличаются друг от друга. 16, 17 пара к субметацентрическим, а 18 ближе к акроцентрическим. У 16 хромосомы ближе к центромере длинного плеча есть вторичный пояс. Группа -F (19-20) Малые метацентрические хромосомы. Отличить их друг от друга довольно сложно. Самые малые акроцентрические хромосомы. Обе аутосомы (21,22) с путниковые, У-хромосома без спутника.



И так, 13, 14, 15, 21 и 22 аутосомы в малых плечах имеют спутники, и он присоединяется к основной части с помощью спутниковых нитей. В некоторых случаях гомологичные хромосомы, находящиеся в парном состоянии, взаимно соединяются друг с другом при помощи спутниковых нитей. Во время анафазы эти хромосомы не успевают распутывать запутанные спутниковые нити, из-за чего оба идут в один полюс. В результате одна дочерняя клетка имеет 47 хромосом, а другая 45. Из предыдущей систематики видно, что хромосомы, входящие в одну группу отличить по внешним признакам довольно затруднительно. Но эти хромосомы можно отличить друг от друга выборочным окрашиванием. До окрашивания хромосом на них воздействуют трипсином. Под действием трипсина в хромосомах структура белков (строение) изменяется, т.е происходит денатурация. Такие хромосомы при окрашивании имеют специфические горизонтальные полоски. При окраске одна хромосома никогда не бывает похожей на другую.

Если нужно смотря на форму и длину очень точно различить хромосомы друг от друга , составляется их идиограмма. Идиограмма — это графическое изображение, в котором указаны все морфологические признаки гаплоидного набора хромосом. По свойствам длины генетическая активность хромосом различна. Генетически активная часть называется эухроматин, а не активная гетерохроматин. В основном эухроматин состоит из набора рабочих генов. Поэтому при потере даже маленькой части, в организме происходят огромные изменения, иногда и к смерти. А гетерохроматин обычно состоит из группы нерабочих генов, т. к. молекула ДНК в этом месте сильно спирализовано. Поэтому организм, потерявший какую-то часть гетерохроматина, не погибает. И так, в соматических клетках человека находится 46 хромосом (23 пары), а в половых клетках 23. При оплодотворении половые клетки сливаются. Поэтому в соматических клетках есть и материнские, и отцовские хромосомы. На основе изучения хромосом человека, было выявлено большинство хромосомных заболеваний.