Biokimyoviy genetika

Molekulyar biologiya jarayonlarining molekulyar asoslarini o'rganishdir takrorlash, transkripsiya, tarjima va hujayra funktsiyasi.^[1]

Biokimyo tiriklikda sodir bo'ladigan kimyoviy moddalar va hayotiy jarayonlarni o'rganishdir organizmlar. Biokimyogarlar ning roli, vazifasi va tuzilishiga jiddiy e'tibor qarating biomolekulalar kabi oqsillar, lipidlar, uglevodlar va nuklein kislotalar.^[10]

Genetika irsiy farqlarning organizmlarga qanday ta'sir qilishini o'rganadigan fan. Genetika qanday qilib bashorat qilishga urinishlar mutatsiyalar, individual genlar va genetik ta'sir o'tkazish a ifodasiga ta'sir qilishi mumkin fenotip ^[11]

Tadqiqotchilar molekulyar biologiyaga xos metodlarni qo'llashgan bo'lsa-da, ularni usullardan birlashtirish odatiy holdir genetika va biokimyo. Molekulyar biologiyaning aksariyati miqdoriy hisoblanadi va yaqinda kompyuter fanlari metodikasidan foydalangan holda katta miqdordagi ishlar amalga oshirildi bioinformatika va hisoblash biologiyasi. Molekulyar genetika, genlarning tuzilishi va funktsiyasini o'rganish, 2000-yillarning boshidan beri molekulyar biologiyaning eng taniqli sub-sohalaridan biri hisoblanadi. Biologiyaning boshqa sohalariga molekulalarning o'zaro ta'sirini to'g'ridan-to'g'ri o'rganish orqali molekulyar biologiya ma'lumot beradi, masalan. hujayra biologiyasi va rivojlanish biologiyasi yoki bilvosita, bu erda tarixiy atributlarni xulosa qilish uchun molekulyar metodlardan foydalaniladi populyatsiyalar yoki turlari, dalalardagi kabi evolyutsion biologiya kabi populyatsiya genetikasi va filogenetik. Shuningdek, qadimgi o'qish an'analari mavjud biomolekulalar "yerdan" yoki molekulyar ravishda, ichida biofizika.^[12]
Molekulyar biologiyaning texnikasi

DNK animatsiyasi
Protein usullari bo'yicha batafsil ro'yxat uchun qarang oqsil usullari. Nuklein kislota usullari bo'yicha batafsil ro'yxat uchun qarang nuklein kislota usullari.
Molekulyar klonlash
Asosiy maqola: Molekulyar klonlash

Transduktsiya tasviri
Protein funktsiyasini o'rganish uchun molekulyar biologiyaning eng asosiy usullaridan biri bu molekulyar klonlash. Ushbu texnikada, qiziqish oqsili uchun DNK kodlash hisoblanadi klonlangan foydalanish polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) va / yoki cheklash fermentlari ichiga plazmid (ifoda vektori ). Vektor uchta o'ziga xos xususiyatga ega: replikatsiya kelib chiqishi, a bir nechta klonlash sayti (MCS) va odatda tanlangan marker antibiotiklarga qarshilik. Ko'p klonlash saytining yuqori qismida joylashgan promouterlik mintaqalari va transkripsiya klonlangan gen ekspressionini tartibga soluvchi boshlang'ich sayt.Bu plazmid bakterial yoki hayvon hujayralariga kiritilishi mumkin. Bakterial hujayralarga DNKni kiritish orqali amalga oshirilishi mumkin transformatsiya yalang'och DNKni olish orqali, konjugatsiya hujayra-hujayra aloqasi orqali yoki transduktsiya virusli vektor orqali. DNKni kiritish ökaryotik hujayralar, masalan, hayvon hujayralari fizik yoki kimyoviy vositalar bilan deyiladi transfektsiya. Kaltsiy fosfat transfektsiyasi kabi bir necha xil transfektsiya texnikasi mavjud. elektroporatsiya, mikroinjeksiyon va lipozoma transfektsiyasi. Plazmid tarkibiga qo'shilishi mumkin genom, natijada barqaror transfektsiya bo'ladi yoki vaqtincha transfektsiya deb ataladigan genomdan mustaqil bo'lib qolishi mumkin.^[13][14]
Qiziqish oqsili uchun DNK kodlashi endi hujayra ichida va oqsil endi ifodalanishi mumkin. Qiziqish oqsilini yuqori darajada ifoda etishga yordam beradigan induktiv promouterlar va hujayralarga xos signal beruvchi omillar kabi turli xil tizimlar mavjud. Keyinchalik ko'p miqdordagi oqsilni bakterial yoki ökaryotik hujayradan ajratib olish mumkin. Oqsilni har xil sharoitda fermentativ faollik uchun sinab ko'rish mumkin, oqsil uning kristallanishi mumkin uchinchi darajali tuzilish o'rganilishi mumkin yoki farmatsevtika sanoatida yangi dorilarning oqsilga qarshi faolligini o'rganish mumkin.^[15]
Polimeraza zanjiri reaktsiyasi
Asosiy maqola: Polimeraza zanjiri reaktsiyasi
Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) DNKni nusxalash uchun juda ko'p qirrali usuldir. Qisqacha aytganda, PCR ma'lum bir narsaga imkon beradi DNK ketma-ketligi oldindan belgilangan usullar bilan nusxa ko'chirish yoki o'zgartirish. Reaksiya nihoyatda kuchli va mukammal sharoitda bitta DNK molekulasini ikki soatdan kam vaqt ichida 1,07 milliard molekulaga aylantirishi mumkin. PCR texnikasi joriy etish uchun ishlatilishi mumkin cheklash fermentlari saytlari DNK molekulalarining uchlariga yoki DNKning ma'lum asoslarini mutatsiyalashga, ikkinchisi esa bu usul deb ataladi saytga yo'naltirilgan mutagenez. PCR yordamida ma'lum bir DNK fragmenti a da topilganligini aniqlash uchun ham foydalanish mumkin cDNA kutubxonasi. PCR ko'plab farqlarga ega, masalan, teskari transkripsiya PCR (RT-PCR ) RNKni kuchaytirish uchun va yaqinda miqdoriy PCR bu DNK yoki RNK molekulalarini miqdoriy o'lchashga imkon beradi.^[16][17]
Jel elektroforezi
Asosiy maqola: Jel elektroforezi

Ikki foiz agaroza jeli yilda borat tampon to'qimasi jel laganda.
Jel elektroforezi molekulyar biologiyaning asosiy vositalaridan biridir. Asosiy printsip shundan iboratki, DNK, RNK va oqsillarni elektr maydon va kattalik yordamida ajratish mumkin. Yilda agarozli gel elektroforez, DNKni elektr zaryadlangan agaroza jeli orqali o'tkazish orqali DNK va RNKni kattaligi asosida ajratish mumkin. Oqsillarni o'lchamlari bo'yicha an yordamida ajratish mumkin SDS-PAGE jel, yoki ularning hajmi va ularning asosida elektr zaryadi a deb nomlanuvchi narsani ishlatib 2D gel elektroforezi.^[18]
Makromolekulani tozalash va tekshirish
Shartlar shimoliy, g'arbiy va sharqiy blotting dastlab bu atamada o'ynagan molekulyar biologiya hazilidan kelib chiqadi Janubiy blotting tomonidan tasvirlangan texnikadan so'ng Edvin Janubiy qoralangan DNKning duragaylanishi uchun. Patrisiya Tomas, keyinchalik RNK-ni ishlab chiqaruvchisi deb nomlandi shimoliy blot, aslida bu atamani ishlatmagan.^[19]
Janubiy blotting
Asosiy maqola: Janubiy blot
Uning ixtirochisi, biolog nomi bilan atalgan Edvin Janubiy, Janubiy blot DNK namunasi ichida ma'lum bir DNK ketma-ketligini tekshirish uchun usul. Oldin yoki keyin DNK namunalari cheklash fermenti (restriksiyon endonukleaza) hazm qilish jel elektroforezi bilan ajratiladi va keyin blotlash orqali membranaga o'tkaziladi. kapillyar harakatlar. Keyin membrana qiziqtirilgan DNKdagi ketma-ketlikni to'ldiruvchi bazaviy ketma-ketlikka ega bo'lgan etiketli DNK zondiga duchor bo'ladi.^[20] Laboratoriya fanida janubiy blotting kamroq qo'llaniladi, masalan, boshqa texnikaning imkoniyatlari tufayli PCR, DNK namunalaridan o'ziga xos DNK ketma-ketliklarini aniqlash. Ushbu qoralanganlar hali ham ba'zi dasturlarda, masalan, o'lchash uchun ishlatiladi transgen nusxa ko'chirish transgen sichqonlar yoki muhandislikda genlarni nokaut qilish embrional ildiz hujayralari chiziqlari.^[21]
Shimoliy blotting
Asosiy maqola: Shimoliy blot

Shimoliy blot diagrammasi
The shimoliy blot ma'lum bir turdagi RNK molekulalarining ekspression naqshlarini o'rganish uchun RNKning turli xil namunalari to'plami o'rtasida taqqoslash sifatida ishlatiladi. Bu aslida kombinatsiyadir denaturing RNK gel elektroforezi va a tozalash. Ushbu jarayonda RNK kattaligiga qarab ajratiladi va keyin membranaga o'tkaziladi, so'ngra markirovka bilan prob qilinadi to'ldiruvchi qiziqish ketma-ketligi. Natijalar ishlatilgan yorliqqa qarab turli yo'llar bilan tasavvur qilinishi mumkin; ammo, aksariyat hollarda namunada aniqlangan RNK o'lchamlarini ifodalaydigan bantlar paydo bo'lishiga olib keladi. Ushbu bantlarning intensivligi tahlil qilingan namunalardagi maqsadli RNK miqdori bilan bog'liq. Ushbu protsedura odatda turli xil namunalarda ushbu RNKning qancha miqdorini o'lchash orqali genlarning ekspressioni qachon va qancha vaqt sodir bo'lishini o'rganish uchun ishlatiladi. Bu tirik to'qimalarda ma'lum genlar qaysi vaqtda va qanday sharoitda namoyon bo'lishini aniqlashning eng asosiy vositalaridan biridir.^[22][23]
G'arbiy blotting
Asosiy maqola: Western blot
Yilda g'arbiy blotting, deb nomlangan texnikada oqsillar avval ikkita shisha plastinka orasiga qo'yilgan ingichka gelda kattaligi bo'yicha ajratiladi SDS-PAGE. Keyin jeldagi oqsillar a ga o'tkaziladi poliviniliden ftorid (PVDF), nitroselüloz, neylon yoki boshqa qo'llab-quvvatlovchi membrana. Ushbu membranani keyin eritmalar bilan tekshirish mumkin antikorlar. Qiziqish oqsiliga maxsus bog'langan antikorlar keyinchalik turli xil texnikalar, shu jumladan rangli mahsulotlar, ingl. xemilyuminesans, yoki avtoradiografiya. Ko'pincha antikorlar fermentlar bilan belgilanadi. Qachon kimyoviy nurlanish substrat ga ta'sir qiladi ferment bu aniqlashga imkon beradi. Western blotting metodlaridan foydalanish nafaqat aniqlashga, balki miqdoriy tahlilga ham imkon beradi. G'arbiy blotatsiyaning o'xshash usullari jonli tarkibidagi maxsus oqsillarni bevosita bo'yash uchun ishlatilishi mumkin hujayralar yoki to'qima bo'limlar.^[24][25]
Sharqiy blotting
Asosiy maqola: Sharqiy blot
The sharqiy blotting aniqlash uchun texnikadan foydalaniladi tarjimadan keyingi modifikatsiya oqsillar. PVDF yoki nitroselüloz membranasida oqsillar ma'lum substratlar yordamida modifikatsiyaga tekshiriladi.^[26]