Extraction of proteins from the microalga Scenedesmus obliquus br003 followed by lipid extraction of the wet deproteinized biomass using hexane and ethyl acetate

---

Contents lists available at
ScienceDirect
Bioresource Technology
journal homepage:
www.elsevier.com/locate/biortech
Extraction of proteins from the microalga Scenedesmus obliquus BR003
followed by lipid extraction of the wet deproteinized biomass using hexane
and ethyl acetate
Matheus Lopes Amorim
a
, Jimmy Soares
a
, Bruno Bezerra Vieira
b
, Willian Batista-Silva
c
,
Marcio Arêdes Martins
a
,
⁎
a
Department of Agricultural Engineering, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais 36570-900, Brazil
b
Department of Chemical Engineering, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais 36570-900, Brazil
c
Department of Plant Biology, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais 36570-900, Brazil
G R A P H I C A L A B S T R A C T
A R T I C L E I N F O
Keywords:
Microlagae biore
finery
Co-products
Solvent recovery
Emulsion
Tetradesmus obliquus
A B S T R A C T
A current problem of the lipid extraction from wet biomass is the formation of emulsions during the mixing of
the microalgal biomass and organic solvents. It has been suggested that microalgal proteins play an important
role in the formation and stability of such emulsions. Herein, the extraction of proteins of the freshwater mi-
croalga Scenedesmus obliquus BR003 was optimized for further extraction of lipids from the wet deproteinized
biomass. The optimal (pH 12 at 60 °C for 3 h) and moderate (pH 10.5 at 50 °C for 2 h) conditions of protein
extraction resulted in protein yields of 20.6% and 15.4%, respectively. Wet lipid extraction of deproteinized
biomass resulted in a less stable emulsion that released twice the solvent than the control biomass. However, the
faster separation of phases that occurred during the wet lipid extraction of the deproteinized biomass resulted in
a lipid yield twice lower than the control biomass.
1. Introduction
The introduction of microalgae as a novel crop in modern agri-
culture might increase the production of food, green chemicals, and
advanced biofuels in a more sustainable manner. Microalgae farming
can be performed in non-arable lands and water sources that are not
suitable for conventional crops (
Mata et al., 2010
). Moreover,
microalgae farming can be developed based on environmental-friendly
processes based on the use of anthropic emissions like carbon dioxide
and wastewaters. However, the insertion of a novel biomass, such as
microalgae, in the market is a long-term process that requires the im-
provement of strains (
Sarayloo et al., 2018
), development of novel
processes (
Sierra et al., 2017
), massive investments (
Benemann, 2013
),
and fair legislation for algae farmers and consumers.
https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.123190
Received 25 January 2020; Received in revised form 12 March 2020; Accepted 13 March 2020
⁎
Corresponding author.
E-mail address:
[e-mail]
(M.A. Martins).
Bioresource Technology 307 (2020) 123190
Available online 17 March 2020
0960-8524/ © 2020 Elsevier Ltd. All rights reserved.

---

Microalgae strains can present fast accumulation of lipids, carbo-
hydrates, proteins, pigments, vitamins, and antioxidants (
Chandra
et al., 2019
). However, the production of microalgae is mostly targeted
for the food market (
Benemann, 2013
), while other applications of
microalgae rely on the development of upstream and downstream
processes adequate for commercial applications. A great e
ffort has been
made over the last decades to convert the biomass of microalgae in
advanced biofuels (
Benemann, 2013
), but the production costs still high
when compared to fossil fuels (
Sun et al., 2019
). The biore
fining is
certainly the most promising strategy to unveil the commercial poten-
tial of microalgae. However, the biore
fining of microalgae is still under
scrutiny and the current processes are economically unattractive.
The production of advanced biofuels from microalgae is not feasible
due to the high consumption of energy to dry the biomass and extract
its lipids (
Dasan et al., 2019
). Thus, the use of wet biomass on lipid
extraction might be a better alternative to improve the energetic e
ffi-
ciency of microalgal biore
fineries. However, it was already shown that
during the wet lipid extraction with nonpolar solvents occurs the for-
mation of an emulsi
fied and stable system (
Law et al., 2018
). The de-
mulsi
fication of such systems containing wet microalgae and nonpolar
solvents is only achieved by high energy-consuming processes, such as
centrifugation. Thus, the development of strategies to attenuate the
emulsion stability is pivotal for the development of e
fficient processes
of wet lipid extraction.
The di
fferent fractions of the microalgal cells play different roles on
the stable emulsions formed between wet biomass and nonpolar sol-
vents: cell debris and protein-rich serum stabilize the emulsion, while
lipids act as a surfactant that lowers the interfacial tension, but does not
contribute to the emulsion stability (
Law et al., 2018
). Indeed, micro-
algae proteins show higher emulsifying capacity and emulsion stability
than commercial emulsifying proteins like the sodium caseinate and soy
protein isolate (
Ursu et al., 2014
). These functional properties of mi-
croalgal proteins show great potential for applications in the food in-
dustry; but the emulsion formed by the nonpolar solvent, water, and
cellular debris during the wet lipid extraction might be a problem for
the production of advanced biofuels (
Law et al., 2017, 2018
).
Interestingly, microalgae species show a very di
fferent number of
proteins, for example, Haematococcus pluvialis shows 18,545 protein-
coding genes, while Chlorella strains show 9349 to 10,240 of these
genes (
Luo et al., 2019; Wu et al., 2019
). Therefore, it is important to
evaluate the e
ffect of dispersible proteins of different microalgae spe-
cies on the formation of emulsions, as well as the screening of strains
with adequate traits for biore
fining because microalgae strains show
di
fferent emulsifying abilities (
Teuling et al., 2019
). There is only one
study addressing the in
fluence of dispersible proteins of the marine
species Nannochloropsis salina on the formation of emulsions during the
wet lipid extraction (
Law et al., 2018
), and little is know about the
in
fluence of proteins of freshwater microalgae on this phenomenon.
Herein,
the
freshwater
strain
Scenedesmus
obliquus
BR003
(Tetradesmus obliquus) was used in the optimization of a process to
extract dispersible proteins, and the deproteinized biomass was subse-
quently submitted to wet lipid extraction. The BR003 strain shows
potential for the production of advanced biofuels (
Rocha et al., 2017
),
fast growth and high production of proteins when cultured in media
based on fertilizers (
Soares et al., 2018
). The wet lipid extraction of
deproteinized biomass was evaluated according to the following para-
meters: lipid yield, emulsion formation and stability. In this study, ethyl
acetate and hexane were used in the wet lipid extraction of the de-
proteinized biomass of S. obliquus BR003. Hexane was chosen to com-
pose the lipid extraction mixture because of its high e
fficiency in the
extraction of lipids when compared to other solvents (
Ramluckan et al.,
2014
). Ethyl acetate was used as a co-solvent because of its excellent
selectivity for neutral lipids (
Lu et al., 2015
).
2. Material and methods
2.1. Cultivation and biomass processing
The microalga S. obliquus BR003 was obtained from the Collection
of Microalgae and Cyanobacteria of the Department of Plant Biology,
Universidade Federal de Viçosa (Minas Gerais, Brazil). The BR003
strain was maintained in liquid culture medium BG11.
The biomass of S. obliquus BR003 was produced in a raceway pond
of 4000 L with natural photoperiod and light during 15 days during the
autumn between 04/20/2018 and 05/05/2018 with a mean tempera-
ture of the culture of 23.8 °C (Viçosa, Minas Gerais, Brazil). The biomass
was harvested when reached the stationary phase on day 15. The cul-
ture medium L4-m was used in the cultivation of the BR003 strain
(
Rocha et al., 2019
). The culture medium L4-m was prepared with
macronutrients provided by inorganic fertilizers: 171.12 mg·L
−1
of urea
(Fertilizantes Heringer, Brazil), 44.36 mg·L
−1
of ammonium mono-
phosphate (Yara Brasil Fertilizantes, Brazil), 176.33 mg·L
−1
of po-
tassium chloride (Fertilizantes Heringer, Brazil), 45.96 mg·L
−1
of
magnesium
sulfate
heptahydrate
(Multitécnica,
Brazil),
and
14.65 mg·L
−1
of iron sulfate monohydrate (Pigminas, Brazil). The
agitation of the culture was achieved by injection of compressed air
enriched with 10% (v·v
−1
) CO
2
. pH was maintained between 7 and 9.5
by injection of CO
2
. Biomass was
flocullated and stored at −20 °C.
For the production of the microalgae powder, the biomass was
thawed and dried until constant weight at 70 ± 1 °C. The dried bio-
mass was size reduced in a knife mill. The S. obliquus BR003 cells were
disrupted in a ball mill for 2 min because unruptured cells hinder sol-
vent access to the internally stored lipids (
Dixon and Wilken, 2018
).
Microalgae powder was standardized by size (100 µm) and stored at
−20 °C.
2.2. Biochemical composition of the S. obliquus BR003
S. obliquus BR003 powder was dried at 105 ± 1 °C until constant
weight for determination of the moisture content. Ash content was
determined by calcination of the biomass at 550 ± 5 °C for 5 h in a
mu
ffle oven. Moisture and ash were measured in quadruplicate.
The content of total lipids of the S. obliquus BR003 powder was
determined by gravimetry based on the Bligh and Dyer method with
previous acid hydrolysis of the biomass to improve the extraction of
free fatty acids complexed with Ca
2+
(
Jensen, 2008
). Lipids were ex-
tracted four times from each sample. Multistage lipid extraction was
performed because a single extraction is not able to completely remove
the lipids from the microalgae biomass (
Du et al., 2017
). Total lipids
were determined in quadruplicate.
Extraction and quanti
fication of total proteins of the S. obliquus
BR003 powder were carried out according to
Borowitzka and
Moheimani (2013)
. Protein quanti
fication was based on the Lowry
protein assay using serum albumin to prepare the standard curve. Total
proteins were determined in quadruplicate.
Extraction and quanti
fication of total neutral carbohydrates of the S.
obliquus BR003 powder were carried out according to
Borowitzka and
Moheimani (2013)
. Total neutral carbohydrates quanti
fication was
based on the phenol
–sulfuric acid method using D-(+)-glucose to pre-
pare the standard curve. Total neutral carbohydrates were determined
in quadruplicate.
2.3. Optimization of the extraction of proteins from S. obliquus BR003
Prior to the protein extraction, the S. obliquus BR003 powder was
suspended in deionized water until 5% (w·v
−1
) total solids because this
concentration is commonly observed in microalgae slurry obtained
after the harvesting and thickening steps (
Borowitzka and Moheimani,
2013
). The extraction of proteins of S. obliquus BR003 was optimized
using a central composite design. The e
ffects of temperature, extraction
M.L. Amorim, et al.