Extraction of proteins from the microalga Scenedesmus obliquus br003 followed by lipid extraction of the wet deproteinized biomass using hexane and ethyl acetate

Bioresource Technology 307 (2020) 123190
6

---

A higher solvent release index was observed in the moderate con-
dition of protein extraction (pH 10.5 at 50 °C for 2 h) that resulted in
the release of 50% of the solvent system after 1 h of the mixture of
solvents and biomass (
Fig. 3
b). On the other hand, the biomass sub-
mitted to the optimal condition of protein extraction (pH 12 at 60 °C for
3 h) showed a release of 50% of the solvent system only after 4 h, while
the control biomass showed a release of the solvent system lower than
40% even after 24 h of the mixture of solvents and biomass (
Fig. 3
b).
The emulsion and solvent release indexes of the deproteinized S.
obliquus BR003 biomasses did not di
ffer significantly after 24 h of the
mixture of solvents and biomass (
Fig. 3
a and b). Conversely, the control
treatment showed a more stable emulsion and a lower release of the
solvent system (
Fig. 3
a and b). These results clearly show that the
dispersible proteins of S. obliquus BR003 play an important role in the
stabilization of the emulsion during wet lipid extraction. The depro-
teinized biomasses released twice the solvent than the control biomass,
which indicates that the control biomass of S. obliquus BR003 releases
water from the emulsion much more easily and retains the solvent
system (
Fig. 3
a and b). A higher solvent releasing diminishes the need
for high-capacity centrifuges and energy input. Industrial centrifuges
are costly and represent up to 16% of the total equipment cost of a
microalgae biofuels production system (
Dasan et al., 2019
).
Lipid extraction from the wet deproteinized biomass of S. obliquus
BR003 produced by the moderate condition of protein extraction (pH
10.5 at 50 °C for 2 h) resulted in a higher lipid yield (27.2 ± 3.1%)
when compared to the control (17.2 ± 1.9%) and optimal condition of
protein extraction (14.6 ± 3.3%) at 0 h after the mixture of solvents
and biomass (
Fig. 3
c). However, the lipid extraction of the control
biomass of S. obliquus BR003 resulted in a higher lipid yield after 24 h
(55.3 ± 4.7%) in comparison to the biomasses produced using the
moderate (26.1 ± 4.3%) and optimal (20.7 ± 2.4%) conditions of
protein extraction (
Fig. 3
c). This indicates that the wet lipid extraction
of the control treatment was strongly in
fluenced by the extraction time
in contrast to the wet lipid extraction of the deproteinized biomasses
(
Fig. 3
c). This fact probably occurred because emulsions show a higher
contact area than the contact area between the two phases separately.
Thus, the higher emulsion and the lower solvent release indexes ob-
served during the wet lipid extraction of the control biomass of S. ob-
liquus BR003 strongly suggest that the solvent system remained longer
with the cellular debris resulting in a greater migration of lipids to the
solvent system phase (
Fig. 3
a and b).
The wet lipid extraction was able to extract only 55.3% of the total
lipids of the control biomass of S. obliquus BR003 (
Fig. 3
c). The main
cause of the low lipid yields is because the lipid extraction was per-
formed with a single stage of extraction (Section 2.5). It was already
shown that a single extraction is not able to completely remove the
lipids from the microalgae biomass (
Du et al., 2017
). Conversely, the
determination of total lipids of S. obliquus BR003 (
Table 2
) was per-
formed using the Bligh and Dyer method, which is traditionally em-
ployed in lipid extraction of microalgae, and the total lipids were ex-
tracted four times (Section 2.2). The main objective of this study was
the evaluation of the in
fluence of dispersible proteins of a freshwater
microalga on the formation of emulsions during wet lipid extraction;
hence the multistage lipid extraction was avoided since a large volume
of solvent is required, which may a
ffect the interpretation of this phe-
nomenon. However, it is possible to conclude that a single wet lipid
extraction is not e
fficient, and the multistage lipid extraction strategy
should be adopted in commercial biore
fineries. Moreover, the lower
lipid yields observed during the wet lipid extraction of the deprotei-
nized S. obliquus BR003 biomasses (
Fig. 3
c) might be, in some exten-
sion, because the protein extraction resulted in some alkaline hydrolysis
of lipids that increased their dispersibility in water and decreased their
migration to the solvent phase (
Salimon et al., 2011
).
The size distribution of the lipid droplets shown that most of the
systems do not form a true emulsion (
Fig. 4
). Emulsions are a type of
colloidal dispersion in which a liquid phase is dispersed in another
liquid phase and the droplet diameter varies between 10 nm and
100
μm (
Damodaran and Parkin, 2017
), and the diameters of the dro-
plets in the systems evaluated in this study ranged from 5
μm to 900 μm
(
Fig. 4
). The greater emulsi
fication that occurred during the wet lipid
extraction of the deproteinized biomass of S. obliquus BR003 resulted in
median droplets with 88.2 and 91.7
μm for the optimal (pH 12 at 60 °C
for 3 h) and moderate conditions (pH 10.5 at 50 °C for 2 h), while the
median droplets of the control was 276.6
μm (
Fig. 4
).
These
findings reinforce the hypothesis that the harsh treatments
employed in the extraction of dispersible proteins change the bio-
chemical composition of the microalga, such as lipids and remaining
proteins, which increased the emulsi
fication capacity of the system
during the wet lipid extraction. In addition, the large droplets observed
during wet lipid extraction of the control biomass S. obliquus BR003
(
Fig. 4
) strongly suggest that the major limiting factor for the separation
of phases is the process of coalescence. This phenomenon, called
Pickering e
ffect, occurs due to the formation of a film composed of
proteins and cellular debris that interact with each other and retain
water and solvent droplets, increases the stability, and physically avoids
the contact and coalescence of the droplets (
Law et al., 2017
).
The results of this current study with the freshwater microalga S.
obliquus BR003 are in agreement with a previous study that evaluated
the formation of emulsions during wet lipid extraction of the marine
species N. salina and showed that the proteins play an important role in
the stabilization of emulsions (
Law et al., 2018
). These authors also
showed that proteins and cellular debris are not good surfactants, but
the lipids improve the emulsi
fication forming small droplets. Therefore,
wet lipid extraction of deproteinized microalgal biomass shows lower
emulsion stability which favors the development of a low-cost solvent
recovery process. However, di
fferent solvent systems, multistage lipid
extraction, and longer mixing should be evaluated in order to increase
the lipid yield.
4. Conclusion
Scenedesmus obliquus BR003 showed a very high content of proteins,
but such proteins could not be easily extracted using a simple, but
optimized, process based on pH, temperature and extraction time. The
addition of SDS drastically improved the protein yield. The wet lipid
extraction of the deproteinized biomass of S. obliquus BR003 using ethyl
acetate and hexane resulted in a system with lower emulsion stability
that certainly will assist the development of e
fficient solvent recovery
processes. On the other hand, decreasing of the emulsion stability re-
quires an e
fficient mixing to favor the extraction of lipids.
Credit authorship contribution statement
Matheus
Lopes
Amorim:
Conceptualization,
Methodology,
Investigation, Writing - original draft.
Jimmy Soares: Writing - review
&
editing,
Conceptualization.
Bruno
Bezerra
Vieira:
Conceptualization, Methodology.
Willian Batista-Silva: Investigation.
Marcio Arêdes Martins: Conceptualization, Advising, Project admin-
istration, Funding acquisition, Resources.
Declaration of Competing Interest
The authors declare that they have no known competing
financial
interests or personal relationships that could have appeared to in
flu-
ence the work reported in this paper.
Acknowledgements
We are thankful to Petróleo Brasileiro S/A for research funding
(grant 4600545175), Brazilian National Council for Scienti
fic and
Technological Development (CNPq, grant 307147/2015-0), Fundação
M.L. Amorim, et al.