Г. А. Тоштемирова1, Н. А. Циферова1,2, С. И. Рустамова

Материалы и методы. В работе использовались следующие вещества: ГК в виде моноаммониевой соли (#50531), α- и β-ГлК (#G8503, #G10105) и карбеноксолон (#С4790, Sigma-Aldrich).
Опыты проводили на тимоцитах, выделенных из тимуса 6-8 недельных белых беспородных крыс (100–150 г). Все процедуры проводились с соблюдением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.), в строгом соответствии с рекомендациями ARRIVE (https://arriveguidelines.org) и были заранее одобрены Комитетом по биоэтике Института биофизики и биохимии. Выделение тимоцитов проводили по стандартной методике, описанной в [8, 9, 10] с некоторыми модификациями. Животных анестезировали диэтиловым эфиром, декапитировали, выделенный тимус расщепляли острым пинцетом до однородной массы, которую пропускали через нейлоно­вую сетку с размером ячейки 100 мкМ. Суспензию клеток промывали 2 раза средой RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), содержащей NaHCO₃, глутамин и антибиотики (пенициллин и стрептомицин) без сыворотки. На конечной стадии выделения клетки суспендировали в среде RPMI–1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка, NaНСО₃, глутамина и антибиотиков. Концентрацию клеток в суспензии определяли путем подсчета в гемоцитометре в модификации по Нойбауэру (Neubauer chamber, Erma Inc., Tokyo, Japan) и суспензию разводили в той же среде до требуемой номинальной концентрации (1-3 млн/мл) в объеме 10-20 мл, в зависимости от условий эксперимента. Далее суспензию клеток разливали по 1 мл в лунки 24-луночной микроплаты. При необходимости в суспензию клеток добавляли исследуемое вещество из концентрированного в 1000 раз раствора в диметилсульфоксида (ДМСО). После добавления веществ в экспериментальные растворы конечная концентрация ДМСО не превышала 0,1%, при этой концентрации влияние растворителя на регистрируемые экспериментальные параметры было незначительным. Далее клетки инкубировали при 37⁰С, 5% CO₂, и число клеток в суспензии определяли в гемоцитометре (Нойбауэра) или в счетчике клеток Corning Cell Counter (Corning Inc., США) сразу (t=0) и через 0 и 24 часа инкубации.
Для определения жизнеспособности тимоцитов, в стандартную пробирку вносили 10 мкл клеточной взвеси (около 10⁷ клеток/мл) и 10 мкл раствора мембрана непроницаемого красителя трипанового синего. Ресуспендировали клетки пипетированием. Без промедления вводили каплю клеточной взвеси в камеру Горяева и оставляли примерно на 1 мин, чтобы клетки осели на дно. В течение следующих 3 мин подсчитывали 100 клеток, отмечая голубые (погибшие) и неокрашенные (живые) тимоциты. В некоторых экспериментах концентрацию клеток в суспензии определяли в гемоцитометре в модификации по Нойбауэру. В наших экспериментах, клеточные суспензии содержали не более 5% погибших клеток.
Данные анализировали с использованием программы Origin, версии 8 (OriginLab, Northampton, MA, США). Все данные приведены как среднее ± стандартная ошибка для n экспериментов. Сравнения между двумя экспериментальными группами проводили с использованием t-теста Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при P < 0,05.