Кимёда физикавий усуллар

VI. Парамагнит нишонлаш услуби ёрдамида оқсиллар
ва нуклеин кислоталар тузилишини ўрганиш
Радиоспектроскопиянинг услубларидан бўлган электрон парамагнит резонанс спектроскопия (ЭПР) асосида атом ёки молекуладаги жуфтлашмаган электронлар магнит моментини ташқи магнит майдони ўртасидаги таъсирлар ётади. Шунинг учун ҳам ЭПР спектроскопия озод радикалларнинг ҳосил бўлиши ва йўқолиши билан боғлиқ бўлган ҳамма тадқиқот ишларида кенг миқёсда ишлатилади, чунки бундай радикалларда жуфтлашмаган электронлар бўлиб; уларнинг парамагнит хусусиятини белгилайди. Биополимерларнинг тузилишини ўрганишда иминоксил озод радикалларнинг ЭПР спектрларини ўрганиш учун уларни "парамагнит нишон" сифатида макромолекулага бириктирилади ва натижада унинг конформациясидаги ўзгаришларни ўрганиш мумкин. "Парамагнит нишон" ёрдамида “нишон” бириккан жойидаги оқсил молекуласи юзасининг шаклини, денатурация жараёнига учратадиган омиллар,' температура ва рНлар таъсирида оқсил молекуласининг тузилиши ўзгариши натижасида "нишон" яқинидаги конформацион ўтишларни, айрим оқсил молекуласидаги бўлакларда бўладиган конформацион ўзгаришларни, оқсиллардаги айрим функционал гурухлар орасидаги масофани ва унинг маълум жараён таъсирида ўзгаришини ўрганиш мумкин. "Парамагнит нишон" сифатида ишлатиладиган иминоксил гурухи ЭПР спектрида яхши тахлил қилинадиган, ажралиб чиқадиган чизиқлар ҳосил қилади, улар молекула харакатланишига ва тузилишида бўладиган ўзгаришларга анча сезгир ҳисобланади.
Биологик фаол моддалар, биринчи навбатда оқсиллар-нинг тузилиши ва хоссаларини ўрганишда "парамагнитли нишон" услубини 1965 йилда Гарден Мак-Коннелл (А+Ш) таклиф қилган. "Парамагнитли нишон" иминоксилдан ва оқсил кимёси учун ишлатиладаган махсус кимёвий бирикмадан синтез қилинади. Иминоксил радикали оқсилнинг айрим гурухларига бирикади. Биологик системаларда нишоннинг концентрацияси жуда кам бўлгани, тажриба паст температура оралиғида олиб борилгани, ҳамда ўта нозик таъсирлар эритувчига кам боғлиқ бўлгани учун ЭПР сигналларининг тахлили соддалашади. Шунинг учун биомолекулага бириккан иминоксил радикалининг сигнал чизиқларининг шакли тахлил қилинади, чунки иминоксил харакатчанлигига атрофидаги ҳолат катта таъсир этади.
Нишонланган оқсилнинг ЭПР спектри ёрдамида макромолекула томонидан нишонни боғлаб олишини қийин ёки осонлиги аниқланиб, боғлаб оладиган бўлакнинг табиати ҳақида маълумот олинади. ЭПР бу ҳолатда моделли эритманинг кучли тормозланган спектрига мос келади.
Маълумки, ЭПР спектри эритманинг ёпишқоқлигига боғлиқ. Ёпишқоқлик кам бўлса озод радикаллар тез айланиб туради ва натижада ташқи магнит майдонига эркин ҳолатда йўналтирилган бўлади (а). Эритмада ёпишқоқликни оширадаган модда (глицерин) бўлса айланиш секинлашади ва олинган спектр "кучсиз тормозланган" спектр (б), аммо жуда паст температурада худди шундай эритмада "кучли тормозланган" спектр олиниб, сигналлар кенг шаклда намоён бўлади (74-расм).

74-расм. Иминоксил радикаллари эритмаларининг ЭПР спектрлари: а-сувда, б-сувли глицеринда, в-сувли глицеринда (-196°С)

74-расмда кўрсатилганидек, "в" кўринишдаги спектрнинг оқсилда бўлиши, оқсилнинг жуда секин айланишини кўрсатади, спинли нишон оқсилга нисбатан харакат қилмайди, аммо оқсилга мустахкам боғланиб қолган бўлади. Бу ҳолат оқсил сиртида нишон бирикиб оладиган жой, яъни "чўнтак" бўлганида кузатилади. Спин нишон ёрдамида оқсил молекулаларида "чўнтак" бўлишини тасдиқлаш билан бирга унинг юзаки ёки чуқур бўлишлигини аниқлашга имкон беради.

Парамагнитли нишонлаш оқсил тузилишда бўладиган жуда ҳам нозик ўзгаришларга сезгир услуб ҳисобланади. Оқсилларнинг айрим бўлакларга парчаланиши, уларнинг денатурацияси, ионланиш натижасида полипептид занжирининг чўзилиши ҳамда бошқа тузилишда бўладиган ўзгаришлар нишонларнинг тормозланишига сабабчи бўлиб радикалнинг эркин айланиш вақтини камайтиради. Шунинг учун ҳам спин-нишонлаш ёрдамида оқсилнинг маълум бўлакларидаги конформацион ҳолатларини ўрганиш мумкин.
Парамагнит нишон билан рентген-тузилиш анализининг берган маълумотлари бир-бирини тўлдиради. Спин-нишон ёрдамида рентген орқали олиб бўлмайдиган биополимерни табиий шароитдаги, яъни сувли эритмада уларда борадиган жараёнларни ўрганиш мумкин.
Россия фанлар академияси кимёвий физика институтида спин нишонлашнинг ўзига хос услублари ишлаб чиқилди, масалан, айрим гурухлар ўртасидаги масофани баҳолаш мақсадида қўшалоқ парамагнит нишонлаш таклиф этилди (К.И. Замарев, Г.Л.Григорян, Г.И.Лихтенштейн, 1970). Бунинг натижасида миоглобин, лизоцим, гемоглобин, ферродоксинлардаги rypyхлap орасидаги масофага изоҳ берилди.
Нуклеин кислоталарининг тузилишини ўрганишда спин-нишонлашни ишлатиб ЭПР спектрдан маълумотлар олиш маълум қийинчиликлар туғдиради. Бунга асосий сабаб, спин-нишон билан нуклеин кислота таркибидаги фосфат гурухлари, рибоза халқасининг гидроксил гурухлари ҳамда пиримидин ва пурин асосларининг аминогурухлари реакцияга киришади. Бу эса ўз навбатида олинган натижаларни тахлил қилишда анча қийинчиликларга олиб келади. Шунинг учун нуклеин кислоталарига спин-нишонлаш услубини ишлатиш учун уларга танловли синтез йўлларини ишлаб чиқиш аҳамиятлидир.
Оддийроқ тузилишга эга бўлган транспорт рибонуклеин кислоталари (т РНК) 70-80 та нуклеотиддан ташкил топган бўлиб, унинг асосий вазифаси махсус аминокислоталарни, масалан, валинни боғлаб олиш (аминоациллаш жараёни) ва оқсилнинг биосинтез бўладиган жойига етказиб беришдир. Аминокислоталарнинг функционал гурухлари, (масалан, -NH- валинда, SH-цистеинда) аминоацил -тРНК да спин-нишонлардаги танловли синтезда муҳим манба ҳисобланади.
Спин-нишонли аминоацил-тРНК нинг ЭПР спектрларини турли хил рН, хароратнинг паст ва юқори қийматларида ўрганилган. Уй хароратида полинуклеотид занжири учламчи тузилишга эга бўлиб, юқори хароратда эса бу шаклдан озод бўлади, олинган бундай хулоса бошқа усуллар томонидан ҳам тасдиқланган.
ЭПР спектроскопия ёрдамида доривор моддаларга иминоксил радикалини бириктириб, унинг метаболизмини ва киши организмида тақсимланишини ўрганишнинг катта келажаги бор, чунки бу тадқиқот ишларини олиб бориб физиологик фаол моддаларнинг таъсир механизмини ўрганиб, янги турдаги керакли дориларни топишга ва уни амалиётга тадбиқ этишнинг имкони бўлади.