Mavzu: havo va suvdagi mikroorganizmlarni aniqlash usullari

3-4-AMALIY MASHG’ULOTLAR
MAVZU: HAVO VA SUVDAGI MIKROORGANIZMLARNI ANIQLASH USULLARI.
Ishdan maqsad: Havo va suvdagi mikroorganizmlarni aniqlash usullarini o‘rganish va ozuqa muhitini tayyorlash usullarini o‘rganishdan iborat.
Havo mikroflorasi
Suv va tuproqdan farqliroq, havoda mikroblar faqat hayot qobiliyatini vaqtincha saqlab turadi, so‘ngra nam yetishmasligi, quyosh nurlarining ta‘siri, harorat o‘zgarishi, oziq moddalar yo‘qligi kabi noqulay faktorlar ta‘sirida o‘lib ketadi. Mikroblarni havoda saqlanib turishini ma‘lum darajada muollaq turovchi suv, chang zarralari taminlab turadi. Uy, turar joy xonalari havo mikroflorasi tarkibi va miqdori jihatdan atmosfera florasidan tubdan farq qiladi. Bakteriyalar va ularning patogen formalari uy, turar joy xonalarida uchrashi birmuncha atmosfera havo mikroflorasidan ko‘p uchraydi, chunki bu muhitlarga kasal odam va hayvonlar, bakteriya tashib yuruvchilardan tushishi mumkin. Havo mikroflorasi ham shartli doimo (rezident) topiluvchi (Micrococcus roseus, M. flavus, M. candicanis, Sarcina . flava, S. alba, Bacillus subtilis, Actinomyces va Penicllium, Aspergillus, Mucor zamburug‘lar va sporadik doimo topilmaydigon (suv va chang zarralari bilan tushovchi ) mikroorganizimlarga bo‘linadi. Patogen mikroorganizimlar og‘iz bo‘shlig‘i yoki nafas yo‘llari kasallanganda atrofdagi havoga patogen mikroorganizimlar: stafilokokk, streptokokk, bo‘g‘ma, ko‘k yo‘tal, sil qo‘zg‘atuvchilari, viruslardan gripp, qizomiq qo‘zg‘atuvchilari tarqaladi. Bu mikroorganizimlar havoda aerozol tarkibida uchraydi. Aerozol- bu kolloid sistema bo‘lib, asosiy tarkibi havo, suyuqlik yoki qattiq moddalar, zarralaridan iborat bo‘ladi. Ayrozol o‘lchami 10 dan 2000 nm teng bo‘lishi mumkin. Odam aksirganda 40 000dan ortiq aerozollar hosil bo‘ladi. Aerozollar o‘lchami,elektirik zaryadi, havodagi harakat tezligi bo‘yicha tomchi, changli va tomchi yadroli fazalarga bo‘linadi. Biz uchun eng muhimi tomchi yadroli aerozol bo‘lib uning o‘lchami 100 nm atrofida bo‘ladi, aerozolni bu fazasi uzoq vaqt havoda saqlanishi tarkibida ma‘lum miqdorda namlik bo‘lganligi uchun chidamli aerodispers sistemani havoda shakillantiradi. Ulardagi namlik bakteriyalarni havoda uzoq vaqt saqlanishini taminlaydi. Masalan, yadroli aerozolda bo‘g‘ma qo‘zg‘atuvchisi 1 sutkagacha, gemolitik streptokokk 2 kungacha, sil qo‘zg‘atuvchisi 18 kungacha hayot faoliyatini saqlab qolishi mumkin. Bu esa odatda yopiq binolarda yuqumli kasalliklar qo‘zg‘atuvchilarini havo-tomchi yo‘li bilan tarqalishi uchun qulay sharoit yaratiladi, chunki hona havosida patogen bakteriyalar miqdori ko‘p bo‘lishi mumkin.
Atrof-muhit ob‘ektlarini sanitariya-bakteriologiya jihatdan baholash. Atorf - muhitdagi turli ob‘ektlar: suv, tuproq, havo va oziq-ovqat mahsulotlarining sanitariya-gigiena holatini baholash uchun sanitariya-bakteriologik tekshiruvlar o‘tkaziladi. Tekshiruv o‘tkazishdan maqsad ko‘rsatilgan ob‘ektlarning epidemiologiya jihatidan havfsiz ekanligini aniqlash. Ulardan patogen mikroorganizmlarni ajratib olish, epidemiologik nuqtai nazardan havfli ekanligini ko‘rsatadi. Bu mikroorganizmlar ob‘ektlarda kam miqdorda bo‘lib, ular havo, suv va tuproqda ko‘paymaydi, ularni to‘g‘ridan-to‘g‘ri ajratib olish ham juda qiyin. Shu boisdan, sanitariya-mikrobiologiya amaliyotida tashqiy muhitning patogen mikroblar bilan ifloslanish ehtimolini bilvosita ko‘rsatkichlar- sanitariya ko‘rsatkich mikroorganizimlarini topilishi asosida aniqlanadi. Ob‘ektning mikroblar bilan zararlanganligini umumiy mikroblar soni, (UMS) bo‘yicha aniqlash mumkin. Ya‘ni, tekshirilayotgan ob‘ektlarning ma‘lum hajmi yoki massasidagi (1 ml suvda, 1 g tuproqda, 1 m3 havoda) mikroorganizmning umumiy soni aniqlanadi. Tuproq va suvdagi mezofil aerob va fakultativ bakteriyalarning umumiy miqdori bo‘lib, agarli muhitda 37ºC va 24 soatda 2 marotiba katalashtirilganda ko‘zga ko‘rinovchi koloniyalar hosil qilishi Sanitariya ko‘rsatkichli bakteriyalarning borligi ikkita ko‘rsatkich — (titr va indeks) orqali baholanadi. Bitta sanitar ko‘rsatkich bakteriyasi topilgan suv va tuproqning eng kam miqdoriga titr va 1 l suyuqlikda;. 1 g tuproqda yoki zich moddada, 1 m³ havoda topilgan sanitariya-ko‘rsatkichli bakteriyalar soniga — indeks deyiladi. Sanitariya-ko‘rsatkichli bakteriyalarga odam va hayvon organizmidagi doimiy mikrofloraning vakillari kiradi. Ular ichak yoki nafas yo‘llarida yashaydi. Ular quyidagi xususiyatlarga ega:
1) mikroorganizimlar doimiy ravishda odam va xayvonlar organizmida yashashi va tashqiy muhitga, ko‘p miqdorda nafas yoki nafas yo‘llaridan shilimshiq tomchilar bilan ajralishi;
2) mikroblar tashqi muhitda ko‘paya olmasligi (oziq ovqatlardan tashqari) yoki uning ko‘payishi juda qisqa bo‘lishi;
3) atrof-muhitda, ichak yoki nafas yo‘lida parazitlik qiluvchi patogen bakteriyalar qancha vaqt yashasa, ular ham shuncha vaqt mobaynida yoki ulardan ko‘proq yashash qobiliyatiga ega bo‘lishi;
4) tashqi muhitga ularning chidamligi o‘zlari singari yashash muhitlariga ega bo‘lgan patogen bakteriyalarga o‘xshash bo‘lishi yoki ulardan ustun turishi va o‘z xususiyatini o‘zgartirmasligi;
5) tashqi muhitda ularga yashash xususiyatlari yaqin bo‘lgan, o‘xshash bakteriyalarning bo‘lmasligi;
6) ularni aniqlash, ajratib olish va identifikasiya usullari oson va ekonamik jihatdan qulay bo‘lishi;
Keltirilgan xususiyatlar bir qator bakteriyalarga xos bo‘lib, atrof-muhitdagi turli ob‘ektlar uchun sanitariya ko‘rsatkichi deb qabul qilingan.
Tuproq na‘munasini olish
Sanitar bakteriologik tekshirish uchun tuproq na‘munasi qo‘yilgan maqsad asosida tekshirilayotgan uchastkani ma‘lum kvadratlaridan (5 x 5 m. kam bo‘lmaslik kerak) ―konvert‖ usulida (4 ta na‘muna diagonal bo‘yicha va 1 ta markazdan) olinadi. Na‘munalar tuproqni 20-30 sm. chuqurlig‘idan 200 g, tuproqni bakteriologik ifloslanganini aniqlash uchun esa 20 sm chuqurlig‘idan olinadi. Olingan na‘munalar maxsus steril idishlarga solinib laboratoriyaga jo‘natiladi. Tuproq na‘munalari zarur sharoit kelib chiqqanda 24 soat muzlatkichlarda saqlanishiga ruxsat beriladi.
Tuproqni tekshirish uchun tayyorlash. Beshta nuqtadan olingan tuproq na‘munalari maxsus idishda aralashtirilib undan 10 -30 g tortib olinadi va 1 : 10 nisbatda sterillangan vodoprovod suvi bilan tuproq suspenziyasi tayyorlanadi (10 g tuproq + 100 ml suv). Bu asosiy suspenziyadan qo‘yilgan maqsad asosida suyultirilgan (10- 2, 10-3, 10-4, 10-5 va x.) na‘munalar tayyorlaniladi. Tuprqni sanitar-mikrobiologik baho berishda tuproqdagi UMS va SKB koli-titri va perfringensni titri aniqlanadi. Tuproqdagi umumiy mikroblar sonini topish –ohirgi 2 ta suyultirilan na‘munadan oziqli muhitning yuzasiga 0,1 ml olinib shpatel bilan (GPA yoki suslo-agarga) ekiladi. Ekilgan ekma 48 soat termostatda saqlanib, oziqli muhitlarda o‘sib chiqqan koloniyalar soniga qarab 1 g turoqdagi UMS topiladi. Masalan 10-4 nisbatda suyultirilgan na‘munadan ekilgan chashkada 41 koloniya topildi, 10-5 dan esa 33.
Tuproqni koli-titri va perfringensni titrini aniqlash
Tuproqni koli yoki perfringens titri deb, bitta ichak tayoqchasi yoki perfringens topilgan tuprqni eng kam miqdoriga aytiladi. Tuproqdagi ichak tayoqchasini koli –titrini aniqlashda elektiv muhitlar ishlatiladi. Bu muhitlar tarkibi qo‘shimcha mikroblarni o‘sishini to‘xtatib qo‘yuvchi o‘t saprosi, gensian violet tutadi, lekin ichak tayoqchasini o‘sishiga to‘sqinlik qilmaydi. Eng ko‘p qo‘llaniladigan suyuq Kissler muhiti xisoblanadi, uning tarkibida yuqorida aytilgan kompanentlardan tashqari E. coli bijg‘itib gaz hosil qilishi uchun pepton va laktoza tutadi. Gaz hosil bo‘lganini aniqlash uchun muhitga bir tamoni payatlangan shisha po‘kak solib qo‘yiladi, hosil bo‘lgan gaz po‘kakga yig‘iladi. Tuproq suspenziyasining suyultirilganidan 1 ml dan Kessler muhiti bo‘lgan probirkalarga ekiladi va termostatda 43°C da 48 soat davomida saqlanadi. 48 soatdan keyin Kissler muhiti ko‘zdan kechiriladi va musbat reaksiyali probirkalar (E. coli muhitda gaz hosil qilib, loyqatib o‘sadi) ajratib olinadi va Endo muhitiga musbat na‘munalardan qayta ekiladi va termostatga 37°C 24 soatga qo‘yiladi. Muhitda to‘q qizil metal singari tovlanib turgan koloniyalar hosil bo‘lsa va surtma tayyorlanib bo‘yab ko‘rilganda gram manfiy tayoqchalar topilsa E. coli deb xulosa qilinadi. Keyinchalik suvning koli-titrini aniqlashda qo‘llaniladigann sxema bo‘yicha analiz o‘tkaziladi va tuproqni koli titri topiladi. Tuproq suspenziyasining perfringens-titrini topish uchun, turli darajada suyultirilgan suspenziyadan 1 ml ( sporsiz bakteriyalar o‘smasligi uchun suyultirilgan tuproq suspenziyasi 80°CV da 10-15 minut qizdiriladi) dan yog‘siz, steril sut yoki tayyorlangan temir sulfitli Vilson-Bler muhit quyilgan probirkalarga yex tempore (tezlikda) ekiladi. Bu ekmalar 43°C da termostatda 24-48 soat davomida saqlanadi, so‘ng sutning chirishi yoki Vilson-Bler muhitining agarli ustunchasida hosil bo‘lgan Cl. perfringens qopa koloniyalarga ko‘ra xulosa chiqariladi. Koloniyalardan surtmalar tayyorlanib, Gram usuli bilan bo‘yaladi. Mikroskop ostida ko‘rilgandan so‘pg, perfringens titri aniqlanadi.
Muhit tarkibi. Kessler muhiti 1% peptonli suv, 5% o‘t sapro, 0,25% laktoza va grammusbat bakteriyalarning o‘sishini to‘xtatish uchun gensian binafshadan iborat. Temir sulfitli Vilson-Blyer muhiti 3% oziqli agar, 1% glyukoza, 2% natriy sulfit, 0,08% temir xloriddan qo‘shilgan. Termofil (issiqni sevuvchi) bakteriyalarni aniqlash uchun suyultirilgan tuproq suspenziyasidan 1 ml Petri kosachasiga tomiziladi, ustidan eritilgan va sovutilgan oziqli agar quyiladi. Ekmalar 60°C da termostatda 1 kun saqlanadi. So‘ng hosil bo‘lgan koloniyalar sanalib, 1 g tuproqdagi bakteri yasoni aniqlanadi.
Aniqlash. Usulni mohiyati tekshirilayotgan suvni ikkitadan kam bo‘lmagan na‘munasi 1,0 ml olinib, oziqli muhitga ekib, o‘sgan koloniyalarni sanab xisoblashga asoslangan. Tadqiqot usulini bajarilishi tekshirilayotgan suv yaxshilab aralashtirilib 1,0 ml dan olingan suvlar sterillangan Petri kosachasiga ( diametri 90- 100 mm) quyiladi, ustiga 10-12 ml eritilgan, 45-49°C gacha sovutilgan oziqli agar quyiladi va yaxshilab suv bilan aralashtiriladi. So‘ngra ekilgan materiallar 37°C da termostatda 24 soatga qo‘yiladi. So‘ng har ikkala kosachadagi agar yuzasida va ichida o‘sib chiqqan koloniyalar soni sanaladi, qo‘shilib ikkiga bo‘linib, suvning 1 ml dagi umumiy mikroblar soni aniqlanadi (xisoblab topish tuproqning UMS aniqlashga o‘xshash, faqat na‘muna 1.0 ml lingani uchun 10 ko‘paytirilmaydi) Natija 1 ml suvda topilgan bakteriyalarni koloniya hosil qiluvchi birligida (KHQB) beriladi.
Umumiy va termotolerant koliform bakteriyalarni membra filtrlash usulida aniqlash. Usulni mohiyati tekshirilayotgan suvni maxsus membrana filtridan o‘tkazilib, laktoza tutuvchi differensial muhitda o‘stirib, kultural va bioximik xususiyatlari bo‘yicha identifikasiya qilishga asoslangan. Tadqiqot usulini bajarilishi. 3-nomerli membranali filtr Bunzep kolbasiga o‘rnatilgan Zeyts voronkasiga joylashtirilib, so‘ngra vakuum-nasos bilan birlashtiriladi Membranali filtrlar oldindan distillangan suvda qaynatilib, sterillanadi.Ichimlik suvlari uchun na‘muna 300 -500 ml, ochiq suv havzasidan olingan toza suv 5, 10, 40, 100, 150 ml hajmda filtrlanadi. Agap suv nihoyatda ifloslapgai bo‘lsa, filtrlashdan oldin steril distillangan suv bilan suyultiriladi. Ichimlik suvni tekshirishda 3 ob‘yom 100 ml dan olinadi, har bir ob‘yom suv filtrdan o‘tkaziladi. Filtrlar Petri kosachasidagi Endo muhiti yuzasiga qo‘yiladi va 37°C da termostatda 24 soat saqlanadi. Agar filtr yusasida 24 soat maboynida koloniyalar o‘smasa yoki koliform bakteriyalarga xos bo‘lmagan mog‘ar zamburug‘lari koloniyasi topilsa, umumiy koliform bakteriya (UKB) va termotolerant koliform bakteriya (TKB) topilmadi deb natija beriladi. Agar membrana filtrda tipik aloxida yotgan laktozamusbat, qizil metal singari yaltiroq, yoki rangsiz koloniyalar topilsa, har ikkala tip koloniyalar aloxida sanalib ularning UKB va TKB mansubligi aniqlaniladi. UKB tasdiqlash uchun filtrda 5 tadan kam, lekin 3-4 tadan har bir tipdagi koloniyalardan, TKB ni tasdiqlash uchun hamma tipik aloxida koloniyalardan 10 tadan oshmagan holda oksidaza aktivligi, Gram usulida bo‘yalishi va laktozani kisota gaz hosil qilib fermentlashi aniqlanadi. Oksidaza testini qo‘yishda oksidaza disklaridan foydalaniladi (dimetil-p-fenilendiamin shimdirilgan filtr qog‘ozi). Membrana filtrlarda koloniyalar qalin o‘sgan bo‘lsa, oksidaza diski to‘g‘ridan to‘g‘ri filtr ustidagi koloniyalarga distillangan suv bilan namlab qo‘yiladi, ko‘k ranga kirsa reaksiya musbat bo‘ladi. Agar filtr yuzasidagi hamma koloniyalar oksidazamusbat bo‘lsa tekshirish to‘xtatiladi va na‘munadan UKB va TKB topilmadi deb javob beriladi. Agar koloniyalar oksidaza manfiy bo‘lsa tekshirilayotgan koloniyalar qayta ekilib aloxida koloniyalar olinadi va ularni UKB va TKB mansubligi o‘rganiladi. Koloniyalarni UKB mansubligi gram manfiy bakteriyalar koloniyasi oksidaza manfiy va laktozani kislota, gaz hosil qilib 37°C da fermentasiya qilsa, ularni UKB mansubligi tasdiqlanadi. TKB mansubligi esa shu testlarni 44°S da aniqlanadi. Boshqa hollarda agar na‘munalardan UKB va TKB topilmasa tekshirilgan 100 ml suvda KHQB UKB va 100 ml suvda va KHQB TKB topilmadi deb javob beriladi.