Mavzu: Koilin – rnk bog’lovchi funksiyalarga EGA multidomen oqsil. Reja: I kirish II asosiy qism

Mavzuning dolzarbligi. Tibbiy genomika biologiya fanining eng tez
rivojlanayotgan yo'nalishlaridan biridir. So'nggi 25 yil ichida kuzatilgan 
tibbiyotning ushbu yo'nalishi "Inson genomi" xalqaro loyihasining boshlanishi bilan 
bog'liq. Ushbu mavzuni chuqur o’rganish,ushbu mavzu haqidagi bilimlarni 
rivojlantirish bugungi kunda asosiy masalalardan biridir. 
Mavzuning o’rganilgan darajasi: Bell, J. L. et al. Insulin-like growth 
factor 2 mRNA-binding proteins (IGF2BPs): post-transcriptional drivers of cancer 
progression? Cell. Mol. Life Sci. 70, 2657–2675 (2013).
Mavzu boyicha shu va 
boshqa adabiyotlardan foydalanildi. 
Kurs ishining maqsad va vazifalari. 
Oqsillarni identifikatsiyalash resursi mavzusini o’rganish hama mutatsion 
kasalliklarning oldini olish chora tadbirlarini rivojlantirishdan iborat. 
 
Kurs ishining tuzilishi:Kurs ishi kirish ,asosiy qism, xulosa 3 ta rasm, 
foydalanilgan adabiyotlar ro’yxati, Jami 27 betdan iborat 
 
1. 
Shavkat Mirziyoev. Tanqidiy taxlil qat’tiy tartib, qat’iy tartib-intizom va shaxsiy javobgarlik-xar bir raxbar 
faoliyatining kundalik qoidasi bo‘lishi kerak. «O‘zbekiston», 2017 yil. 

---

6 
II Asosiy qism 
1.1. O'simlik koilin: tuzilish xususiyatlari va RNK-bog'lanish 
xususiyatlari
 
Kajal jismlar (CB) ribonukleoproteinlar biogenezida ishtirok etadigan 
dinamik subyadro bo'limlari. Coilin - bu CB shakllanishi, tarkibi va faoliyati uchun 
zarur bo'lgan asosiy strukturaviy iskala oqsilidir. Arabidopsis thaliana coilin 
(Atcoilin) ning bashorat qilingan ikkilamchi tuzilishi oqsilning uchta asosiy 
domendan iborat ekanligini ko'rsatadi. O'chirish mutantlarining fizik xususiyatlarini 
tahlil qilish shuni ko'rsatadiki, Atkoilin N-terminal globulyar domendan, markaziy 
yuqori tartibsiz domendan va buzilgan C terminaliga ulashgan taxminiy Tudorga 
o'xshash tuzilmani o'z ichiga olgan C-terminal domenidan iborat bo'lishi mumkin. 
Aminokislotalar ketma-ketligidagi past homologiyaga qaramay, shunga o'xshash 
turdagi domen tashkiloti, ehtimol, inson va hayvonlarning koilin oqsillari va turli xil 
o'simlik turlarining koilinga o'xshash oqsillari tomonidan taqsimlanadi. Atkoilin 
RNKni samarali va o'ziga xos bo'lmagan tarzda bog'lashga qodir. Ushbu faollik 
uchta RNK-bog'lanish joylari tomonidan ta'minlanadi: N-terminal domenidagi 
asosiy aminokislotalarning ikkita to'plami va markaziy domendagi bitta to'plam. 
RNK bilan o'zaro ta'sir Atkoilin molekulasining multimerizatsiyasini keltirib 
chiqaradi, bu N-terminal domenidagi strukturaviy o'zgarishlarning natijasidir. RNK 
bilan o'zaro ta'sir va keyinchalik multimerizatsiya coilinning iskala oqsili sifatida 
ishlashini osonlashtirishi mumkin. N-terminal domenining modeli ham taklif 
qilingan. Kajal jismlar (CB), yadroviy va funktsional jihatdan yadrolar bilan bog'liq 
bo'lgan subyadro bo'linmalari, kichik yadroviy ribonukleoproteinlar (snRNP) ning 
pishishida ishtirok etadi va ularni kichik CB o'ziga xos RNKlar (scaRNAlar) orqali 
o'zgartirish va yig'ishni osonlashtiradi. Bundan tashqari, CBs snRNK genlari, giston 
gen klasterlari, Gems va PML jismlari bilan bog'lanadi, shuningdek, biogenez va 
telomerazani telomerlarga etkazishda ishtirok etadi. CB ko'pincha neyronlar va 
saraton hujayralari kabi yuqori transkripsiya talablari bo'lgan hujayralarda yoki 
viruslar bilan kasallangan hujayra qatorlarida aniqlanadi ([1] sharhiga qarang). 

---

7 
Coilin, CB hosil bo'lishi, tarkibi va faoliyati uchun zarur bo'lgan asosiy 
strukturaviy iskala oqsili, asosan CBlarda topiladi, lekin ayni paytda nukleoplazma 
bo'ylab tarqaladi Koilin ortologlari Ksenopus, sichqoncha, Arabidopsis va 
Drosophilada ketma-ket taqqoslash va klonlash yo'li bilan aniqlangan va bu 
organizmlardagi taniqli yadro jismlarida joylashishi ko'rsatilgan. Koilin 
aminokislotalar (aa) ketma-ketligi yoki o'lchamiga nisbatan kuchli evolyutsion 
saqlanmagan bo'lsa-da, sutemizuvchilar (odam va sichqon) koilin oqsillari istisno 
hisoblanadi, chunki ular o'xshash molekulyar massaga ega (60 kDa atrofida) va 
yuqori homologiya nisbati taxminan 67% umumiy va konservalangan hududlar 
uchun . Bundan farqli o'laroq, inson va Ksenopus coilin o'rtasidagi o'xshashlik bor-
yo'g'i 42% ni tashkil qiladi, bunda Ksenopus coilinda topilgan 508 qoldiq bilan 
solishtirganda, inson spiralida 576 aminokislota qoldig'i mavjud. Umurtqasizlar 
turlarida homologiya darajasi past bo'lib, bu organizmlarda yangi koilin genlarini 
aniqlashni cheklab qo'ydi. Bu nima uchun coilin genlari Caenorhabditis va 
Saccharomyces kabi keng qo'llaniladigan model organizmlarda topilmaganligini 
tushuntirishi mumkin . 
Yaqinda o'tkazilgan nokaut va nokaut tadqiqotlari koilinning to'g'ri CB 
shakllanishi, tarkibi va faoliyati uchun zarur ekanligini ko'rsatdi . HeLa 
hujayralarida koilinning ishdan chiqishi hujayra proliferatsiyasini kamaytirishi 
ko'rsatilgan ehtimol snRNP resurslarining tugashi tufayli. Sichqonlarda coilin geni 
nokautlari gomozigotalarning bir qismidagi o'lim yoki tirik qolganlarda jiddiy 
reproduktiv muammolarni keltirib chiqarishi bilan tavsiflangan subletal fenotipni 
keltirib chiqaradi . Aksincha, homozigotli Ncb-1 Arabidopsis thaliana mutantlari 
bo'lib, ular CB ni hosil qila olmasa ham, to'liq hayotga yaroqli. Shunga o'xshash 
natijalar drozofilaning koilin etishmovchiligi bo'lgan mutantlarida kuzatilgan, bu 
erda CB larning yo'qligi ularning yashash qobiliyatiga ta'sir qilmaydi
Turli xil turlardagi koilin oqsillarida ketma-ketlikni saqlaydigan ikkita muhim 
mintaqa aniqlangan . Bu hududlar oqsilning N- yoki C-terminal qismida ~100 aa 
qoldiqlarini o'z ichiga oladi, ularning joylashuvi bobin olingan turga qarab farq 
qilishi mumkin. Yuqori darajada saqlangan N-terminal domeni bobinning o'z-o'zini 

---

8 
ta'sirini va oligomerizatsiyasini osonlashtiradi . Oxirgi ishlar shuni ko'rsatdiki, C-
terminal saqlanib qolgan hududda Tudorga o'xshash domen mavjud bo'lib, u inson 
bobini holatida 460 va 560 aa qoldiqlari orasida joylashgan . Bu domen atipik 
hisoblanadi, chunki u ikkita katta tuzilmagan halqaga ega. Inson koilinning C-
terminal qismida argininlar va glitsinlarga boy hudud (RG qutisi yoki takrorlash) 
mavjud bo'lib, u Tudorga o'xshash domenning N-terminali. N- va C-terminal 
domenlari orasidagi oqsilning markaziy qismida ikkita yadro lokalizatsiya signali 
ketma-ketligi (NLS1 va NLS2) va taxminiy yadroviy lokalizatsiya signali (NoLS) 
aniqlangan [18]. Qizig'i shundaki, C-terminusning eng distal uchining so'nggi 10 ta 
qoldig'i o'z-o'zidan o'zaro ta'sir qilish uchun N-terminusning mavjudligini nazorat 
qilish, CB shakllanishi va soniga ta'sir qilish va bobinning lokalizatsiyasini 
modulyatsiya qilishda ishtirok etadi . Afsuski, hozirgi kunga qadar domenni tashkil 
etish va coilinning strukturaviy jihatlari aniqlanmagan. 
Coilin omon qolgan motor neyroni (SMN), U snRNPs va Sm oqsillari bilan 
bevosita o'zaro ta'sir qiladi . SMN ning ulanishi RG qutisi orqali amalga oshiriladi, 
bunda arginin qoldiqlarining nosimmetrik dimetilatsiyasi SMN/koilin o'zaro ta'sirini 
oshiradi . Qizig'i shundaki, Arabidopsis thaliana coilin (Atcoilin) tarkibida RG qutisi 
mavjud emas va hozirda Atcoilin tarkibidagi arginin qoldiqlaridan birortasi 
dimetilatlanganligi ma'lum emas. Xuddi shunday, hozirda Arabidopsis genomida 
SMN ning gomologi aniqlanmagan . Sm oqsili va U snRNP bilan bog'lanishi uchun 
inson spiralining C-terminal 156 qoldiqlari kerak bo'ladi . Coilin mitoz jarayonida 
giperfosforillangan konstitutsiyaviy fosfoproteindir . Koilinning fosforlanishi uning 
SMN va Sm oqsillari bilan o'zaro ta'sir qilish qobiliyatiga ham ta'sir qiladi: SMN 
gipofosforillangan koilin bilan bog'lanadi, lekin SmB' fosforlangan koilin bilan 
ko'proq bog'lanadi . Bundan tashqari, coilin Ku oqsillari bilan o'zaro ta'sir qiladi va 
in vitro homolog bo'lmagan DNK uchining qo'shilishini inhibe qilishi mumkin. 
nukleoplazmatik koilin DNK shikastlanishi natijasida kelib chiqqan stressga 
javob yo'llarida rol o'ynashi mumkin. Koilinlarning nuklein kislotalar bilan o'zaro 
ta'siri haqida ko'p ma'lumotlar yo'q, ammo inson va Xenopus koilinlarining N-
terminal qismi ssDNK va poli r (G) ni in vitro bog'lashi ko'rsatilgan. So'nggi 

---

9 
ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, inson bobinlari RNK va DNK bilan birgalikda 
tozalangan, dsDNA bilan in vitro o'zaro ta'sirlashgan va snRNKni qayta ishlashda 
ishtirok etishi mumkin . 
Ushbu ishda biz turli xil kelib chiqishi bo'lgan koilin oqsillari o'xshash 
tarkibiy tuzilishga ega ekanligini ko'rsatamiz, bu bizga Arabidopsis thaliana coilin 
molekulasidagi uchta strukturaviy domenni ochishga imkon berdi. Izolyatsiya 
qilingan domenlar rekombinant oqsillar sifatida ifodalangan va jismoniy va RNK-
bog'lanish xususiyatlari aniqlangan, bu RNK-bog'lanish faolligi uchun mas'ul 
bo'lgan joylarni aniqlash imkonini beradi. CD spektroskopiyasi 
1 mM fosfat tamponidagi pH 7,5 dagi 100 mkg/ml konsentratsiyadagi oqsil 
namunalari 1–2 mm hujayralarga yuklangan va CD spektrlari “Chiroscan” CD 
spektrometrida 25°C da 185 dan 250 nm gacha qayd etilgan (“Ilovaviy”). 
Fotofizika”, Angliya). CD spektrlari asosiy chiziqni olib tashlash bilan 0,5-1,0 nm / 
s tezlikda qayd etilgan. O'lchangan spektrlar asbob dasturi yordamida tekislandi. [th] 
qiymatini hisoblash aminokislota qoldig'ining o'rtacha molekulyar og'irligi 110 ga 
asoslangan. 
Koilin oqsillari (0,03 mg/ml) yoki 1 mM fosfat tamponidagi pH 7,5 protein-
RNK 
komplekslari 
FluoroMax 
(HORIBA 
Jobin 
Yvon, 
AQSH) 
spektrofluorimetrining 1 sm hujayralariga yuklangan. Namunalar 280 nm da 
hayajonlangan va emissiya spektrlari 300 dan 400 nm gacha bo'lgan diapazonda 
qayd etilgan. O'qish 25 ° C da amalga oshirildi. 
0,05 mg/ml 1 mM fosfat tamponida pH 7,5 protein namunalari Zetasizer Nano 
ZS (Malvern Instruments, Buyuk Britaniya) dinamik yorug'lik tarqatuvchi 
qurilmaning 1 sm xujayralariga yuklangan va o'lchovlar He-Ne lazer (633 nm) 
yordamida olingan. . Egri chiziqlar Dispersion Technology Software (DTS) 5.10 
versiyasi yordamida o'rnatildi. 
Coilin oqsilining mutant variantlari Arabidopsis thaliana ketma-ketligidan 
foydalangan holda tuzilgan (NM_101173.4; GI: 42562030). O'chirish mutantlari 
kerakli ketma-ketlikning PCR kuchaytirilishi orqali ishlab chiqarilgan va SphI va 
SalI cheklash joylaridan foydalangan holda PQE30 ifoda vektoriga klonlangan. 

---

10 
Olingan oqsillar N-terminusda 6 × gistidin ketma-ketligini o'z ichiga oladi. 
O'zgartirish mutatsiyalari (R yoki K ni alaninlar bilan almashtirish) bir-biriga 
o'xshash PCR yordamida yaratilgan. 
E. coli ifodasi JM109 shtammi plazmidlar bilan o'zgartirildi va qiziqish 
oqsillari 1 mM IPTG ni 1/20 suyultirilgan tungi madaniyatga qo'shib, 37 ° C da 2 
soat davomida yana chayqatildi. Proteinlar ishlab chiqaruvchining protokoliga 
binoan Ni-NTA Qiagen agaroza (Qiagen, G'arbiy Sasseks, Buyuk Britaniya) 
yordamida denaturatsiya sharoitida tozalandi. 
Strukturaviy tadqiqotlar va RNK bilan bog'lanish tahlillari uchun 
rekombinant oqsillar renaturatsiya qilindi va karbamid 0,1 ml namunani MilliQ 
suvida 1,5 soat davomida xona haroratida 5 marta suv o'zgarishi bilan dializlash 
orqali olib tashlandi. Namunalar 10 000 aylanish tezligida 10 daqiqa davomida 
santrifüjlash orqali tozalash uchun aylantirildi. 
Oqsillarning RNK bilan bog'lanish faolligi gel-shift yondashuvi yordamida 
sinovdan o'tkazildi. RNK va oqsil turli nisbatlarda RNK bog'lovchi buferda (20 mM 
Tris-HCl pH 7,5; 1 mM DTT; 3 mM MgCl2; 50 mM NaCl) aralashtirildi va muzda 
15 daqiqa davomida inkubatsiya qilingandan so'ng namunalar Tris-asetat agarozaga 
yuklandi. etidium bromidi yoki Sybr Gold nuklein kislotasi jeli (Invitrogen) bilan 
bo'yalgan jellar. Jellar suratga olindi va erkin kechikmagan RNK miqdori Gel-Pro 
Analyzer (Version 3.1.00.00, Media Cybernetics) yordamida aniqlandi. U1 snRNK, 
U2 snRNK va pGEM7 RNK substratlari mos keladigan DNK ketma-ketligiga 
ulashgan T7 promouterini o'z ichiga olgan PCR mahsulotlarining T7 transkripsiyasi 
orqali tayyorlangan. 
Protein eritmasi yangi uzilgan slyuda yuzasiga 1 daqiqa davomida 
adsorbsiyalanishiga ruxsat berildi, shundan so'ng eritma filtr qog'ozi bilan 
ehtiyotkorlik bilan olib tashlandi. Ushbu substrat darhol bir tomchi ikki marta 
distillangan Millipore suviga qo'yildi (bu protsedura ikki marta takrorlandi) va sirt 
havo bilan quritildi. Ushbu namunani tayyorlash usuli qolgan tuzlarni yo'q qilish va 
quritish paytida artefakt birikmasini minimallashtirish uchun ishlatilgan. Atom kuch 
mikroskopiyasi (AFM) tahlili ushbu namunalarda Nanoskop IIIA boshqaruvchisi 

---

11 
(Digital Instruments, AQSH) bilan Multimode AFM yordamida, odatda 1 Gts 
skanerlash tezligi bilan teginish rejimida amalga oshirildi. O'lchovlar havoda 
teginish rejimida 10 nm kafolatlangan uchi radiusi bo'lgan o'tkir kremniy konsollari 
(NT-MDT, Rossiya) yordamida amalga oshirildi. Koilin molekulalarida ichki 
tartibsiz hududlar mavjudligini ko'rsatadigan bir nechta belgilar mavjud. 
Birinchidan, turli organizmlarning koilin molekulalari kutilmagan elektroforetik 
harakatchanlikka ega ekanligi ma'lum bo'ldi, buning natijasida janob va prognoz 
qilingan MW o'zaro bog'liq emas [6], [8]; inson, sichqon va Xenopus coilin oqsillari 
bilan kuzatilgan hodisa. Bu janob 90 kDa ga yaqin bo'lgan Atkoilinga ham tegishli, 
garchi u prognoz qilingan MVt 68,7 kDa bo'lsa ham. Ikkinchidan, barqaror to'liq 
uzunlikdagi inson kristallarini ishlab chiqarishga bir nechta muvaffaqiyatsiz 
urinishlar bo'lgan [19]. Tartib/tartibsizlik darajasini aniqlash uchun Atkoilinning 
aminokislotalar ketma-ketligi FoldIndex va DisoPred veb-xizmatlari [28], [29] 
yordamida tahlil qilindi. Shakl 1B shuni ko'rsatadiki, oqsilning markaziy qismi juda 
tartibsiz bo'lib, C-terminusda qo'shimcha ochilgan hududlar aniqlangan. Aksincha, 
konservativ N-terminal mintaqasi va C-terminal qismidagi qismlar Tudorga 
o'xshash domen tuzilishiga mos keladi deb taxmin qilingan (1B-rasm). 
Koilin tuzilishining bioinformatik prognozlaridan foydalanib, biz Atcoilin N-
terminal qismida ikkita tizimli domenni o'z ichiga oladi, shu jumladan N terminalida 
tartiblangan domen (NOD) va markaziy ichki tartibsiz domen (IDD) va C-da kamida 
bitta domenni o'z ichiga oladi. Terminal qismi (C-terminal domeni, CTD) o'ziga xos 
tarzda tartibsiz C-terminusga tutashgan Tudorga o'xshash tuzilishga ega (1A-rasm). 
Qizig'i shundaki, aminokislotalar ketma-ketligidagi sezilarli farqga qaramay, 
turli organizmlarning koilin oqsillarida tartiblangan/tartibsiz hududlarning o'xshash 
namunasi aniqlangan. Masalan, odamlardan olingan koilin oqsillari, Danio rerio va 
Xenopus laevis tuzilgan N-terminal mintaqasini (taxminan 100 aa), uzoq markaziy 
tartibsiz mintaqani va tartiblangan va tartibsiz qismlarni o'z ichiga olgan C-terminal 
mintaqasini taqsimlaydi (S1-rasm). 
Atkoilinning strukturaviy xususiyatlari va uning doiraviy dikroizm va 
triptofan floresan usullari bilan ochilgan taxminiy domenlari 

---

12 
Yovvoyi turdagi (wt) Atkoilin va uning taxminiy NOD (1-117 aa qoldiqlari), 
IDD (117-350 aa qoldiqlari) va CTD (350-608 aa qoldiqlari) domenlariga (1A-rasm) 
mos keladigan rekombinant oqsillar ifodalangan va tozalangan. E. coli (S2-rasm). 
Ularning ikkilamchi tuzilishi dumaloq dikroizm (CD) yondashuvi yordamida tahlil 
qilindi (2A-rasm).