Mavzu: Oqsillarni identifikatsiyalash resursi (Protein Indentification Resource, pir). Reja: I kirish II asosiy qism

Ajratish va miqdoriy miqdor
Aminokislotalarni ajratish mumkin ion almashinadigan xromatografiya keyin ularni aniqlashni osonlashtirish uchun derivatsiya qilingan. Odatda, aminokislotalar hosil bo'ladi, so'ngra eritiladi teskari faza HPLC.
Ion almashinadigan xromatografiyaning namunasi MTRK tomonidan sulfatlangan polistirolni matritsa sifatida ishlatib, aminokislotalarni kislota eritmasiga qo'shib va ​​doimiy ravishda ortib boruvchi buferdan o'tkaziladi. pH ustun orqali. Aminokislotalar pH mos keladigan darajaga yetganda elutatsiya qilinadi izoelektrik nuqtalar. Aminokislotalarni ajratib bo'lgach, ularning ranglarini hosil qiluvchi hosil qiluvchi reaktiv qo'shib ularning tegishli miqdori aniqlanadi. Agar aminokislotalarning miqdori 10 nmoldan oshsa, ninhidrin buning uchun ishlatilishi mumkin; u prolin bilan reaksiyaga kirishganda sariq rang, boshqa aminokislotalar bilan esa jonli binafsha rang beradi. Aminokislota kontsentratsiyasi hosil bo'lgan eritmaning yutilishiga mutanosibdir. Juda oz miqdorda, soat 22.00 gacha, lyuminestsent hosilalar, masalan, reagentlar yordamida hosil bo'lishi mumkin orto-ftaldegid (OPA) yoki floresamin.
Ustundan oldingi derivatizatsiya ultrabinafsha nurlari bilan aniqlanadigan lotin hosil qilish uchun Edman reaktividan foydalanishi mumkin. Kattaroq sezgirlikka lyuminestsent lotin hosil qiluvchi reaktiv yordamida erishiladi. Hosil bo'lgan aminokislotalar, odatda C8 yoki C18 yordamida teskari fazali xromatografiyaga uchraydi. kremniy kolonu va optimallashtirilgan elution gradient. Elitatsiya qiluvchi aminokislotalar ultrabinafsha yoki lyuminestsentsiya detektori yordamida aniqlanadi va namunadagi har bir aminokislotani miqdorini aniqlash uchun hosil bo'lgan standartlar bilan taqqoslaganda eng yuqori joylar.


1 Bogosian G, Violand BN, Dorward-King EJ, Workman WE, Jung PE, Keyn JF (yanvar 1989). "Escherichia coli tomonidan biosintez va norleusin
N- aminokislota terminali tahlili
 
Sangerning peptid guruhini tahlil qilish usuli: A derivatizatsiya N- bilan terminali tugatish Sanger reaktivi (DNFB), B dinitrofenil peptidning umumiy kislota gidrolizi
Qaysi aminokislota hosil bo'lishini aniqlash N-terminus a peptid zanjir ikki sababga ko'ra foydalidir: peptid bo'laklari ketma-ketligini butun zanjirga tartiblashda yordam berish va birinchi tur Edman degradatsiyasi ko'pincha iflosliklar bilan ifloslangan va shuning uchun aniq aniqlik bermaydi N-terminal aminokislota. Uchun umumlashtirilgan usul N- aminokislota terminali tahlili quyidagicha:

1. 
   Peptidni terminal aminokislotani tanlab belgilaydigan reaktiv bilan reaksiyaga kiriting.
   
2. 
   Oqsilni gidroliz qiling.
   

^ Mixail A. Alterman; Piter Xantsiker (2011 yil 2-dekabr). Aminokislotalarni tahlil qilish: usullari va bayonnomalari. Humana Press. ISBN 978-1-61779-444-5.

3. 
   Aminokislotani xromatografiya va standartlar bilan taqqoslash orqali aniqlang.
   

Terminal aminokislotalarni belgilash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan juda ko'p turli xil reagentlar mavjud. Ularning barchasi omin guruhlari bilan reaksiyaga kirishadi va shu sababli lizin kabi aminokislotalarning yon zanjiridagi amin guruhlari bilan ham bog'lanadi - shu sababli to'g'ri joy tanlanganligini ta'minlash uchun xromatogrammalarni izohlashda ehtiyot bo'lish zarur. Eng keng tarqalgan reaktivlardan ikkitasi Sanger reaktivi (1-ftor-2,4-dinitrobenzol) va kabi dansil hosilalari dansil xlorid. Fenilizotiyosiyanat, Edman degradatsiyasi uchun reaktivdan ham foydalanish mumkin. Xuddi shu savollar aminokislota tarkibini aniqlashda bo'lgani kabi amal qiladi, faqat dog 'kerak emas, chunki reaktivlar rangli hosilalarni hosil qiladi va faqat sifatli tahlil talab qilinadi. Shunday qilib, aminokislota faqat standart bilan taqqoslaganda, xromatografiya kolonkasidan chiqarilishi shart emas. Shuni ham hisobga olish kerakki, har qanday omin guruhlari markalash reagenti bilan reaksiyaga kirishganligi sababli, ion almashinadigan xromatografiyadan foydalanish mumkin emas va yupqa qatlamli xromatografiya yoki yuqoribosimli suyuqlik xromatografiyasi o'rniga ishlatilishi kerak.


1.^ Mixail A. Alterman; Piter Xantsiker (2011 yil 2-dekabr). Aminokislotalarni tahlil qilish: usullari va bayonnomalari. Humana Press. ISBN 978-1-61779-444-5.

2.