Mavzu: Oqsillarni identifikatsiyalash resursi (Protein Indentification Resource, pir). Reja: I kirish II asosiy qism

Yangi ketma-ketlik
Peptidning parchalanish modeli uning ketma-ketligini to'g'ridan-to'g'ri aniqlashga imkon beradi de novo ketma-ketlik. Ushbu ketma-ketlik oqsillar ketma-ketligining ma'lumotlar bazalariga mos kelish yoki tekshirish uchun ishlatilishi mumkin tarjimadan keyingi yoki kimyoviy modifikatsiyalar. Yuqorida aytib o'tilganidek, oqsillarni aniqlash uchun qo'shimcha dalillar keltirishi mumkin.
N- va C-termini
Proteinni identifikatsiya qilish paytida mos keladigan peptidlar, mos keladigan oqsil uchun bashorat qilingan N- yoki C-terminini o'z ichiga olmaydi. Buning sababi, N- yoki C-terminal peptidlarni MS tomonidan aniqlash qiyin (masalan, juda qisqa yoki juda uzun), translyatsiyadan so'ng o'zgartirilgan (masalan, N-terminalli asetilatsiya) yoki bashoratdan chinakam farq qiladi. Translatsiyadan keyingi modifikatsiyalar yoki qisqartirilgan terminlar ma'lumotlarni batafsil o'rganish orqali aniqlanishi mumkin (ya'ni.) de novo ketma-ketlik). Har xil o'ziga xoslikdagi proteaza yordamida takroriy hazm qilish ham foydali bo'lishi mumkin.
Tarjimadan keyingi modifikatsiyalar
Translatsiyadan keyingi modifikatsiyani aniqlash uchun MS ma'lumotlarini ma'lum oqsillar ketma-ketligiga asoslangan bashoratlar bilan batafsil taqqoslashdan foydalanish mumkin, shuningdek ma'lumotlar yig'ish uchun maqsadli yondashuvlardan foydalanish mumkin. Masalan, fosfopeptidlarning o'ziga xos boyishi aniqlashda yordam berishi mumkin fosforillanish oqsil tarkibidagi joylar. Mass-spektrometrda peptid parchalanishining alternativ usullari, masalan ETD yoki ECD, qo'shimcha ketma-ketlik ma'lumotlarini berishi mumkin.
Butun massani aniqlash
Proteinning butun massasi uning aminokislota qoldiqlari massasi va suv molekulasi massasining yig'indisidir va har qanday translyatsiyadan keyingi modifikatsiyalar uchun sozlangan. Garchi oqsillar ulardan olingan peptidlarga qaraganda kamroq yaxshi ionlashtirsa-da, eritmadagi oqsil ESI-MS ta'siriga tushishi va uning massasi 20000 dan 1 qismgacha aniqlikda o'lchanishi mumkin. Bu ko'pincha terminini tasdiqlash uchun etarli bo'ladi (shuning uchun oqsilning o'lchangan massasi uning ketma-ketligidan bashorat qilinganiga to'g'ri keladi) va translyatsiyadan keyingi ko'plab modifikatsiyalar mavjudligi yoki yo'qligi haqida xulosa chiqarish.
Cheklovlar
Proteoliz har doim ham POI ketma-ketligini qamrab oladigan, osonlikcha tahlil qilinadigan peptidlar to'plamini beravermaydi. Mass spektrometrdagi peptidlarning parchalanishi ko'pincha har bir peptid bog'lanishida bo'linishga mos keladigan ionlarni hosil qilmaydi. Shunday qilib, har bir peptid uchun chiqarilgan ketma-ketlik to'liq bo'lishi shart emas. Parchalanishning standart usullari leytsin va izoleysin qoldiqlarini izomerik bo'lgani uchun ajratmaydi.
Edman degradatsiyasi oqsilning N-terminalidan kelib chiqqanligi sababli, agar N-terminusi kimyoviy o'zgartirilgan bo'lsa (masalan, atsetilatsiya yoki Piroglutamik kislota hosil bo'lishi bilan) ishlamaydi. Edman degradatsiyasi odatda disulfid ko'priklarining holatini aniqlash uchun foydali emas. Bundan tashqari, sezgir natijalar uchun 1 pikomol yoki undan yuqori peptid miqdori talab etiladi, bu esa undan kam sezgir bo'ladi mass-spektrometriya.


^ Gundry RL, White MY, Murray CI, Keyn LA, Fu Q, Stanley BA, Van Eyk JE (oktyabr 2009). "Oqsillarni va peptidlarni massa spektrometriyasini tahlil qilish uchun pastdan yuqoriga qarab proteomika ish oqimida tayyorlash". Molekulyar biologiyaning amaldagi protokollari. 10-bob: Birlik10.25. doi:10.1002 / 0471142727.mb1025s88. PMC 2905857. PMID 19816929.

4.