Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Фосфомоноэстеразы (фосфатазы). Эти ферменты способны от-
щеплять концевые фосфомоноэфирные группы от ДНК. 
Полинуклеотидкиназа. Данный фермент кодируется геномом 
фага Т4 E. coli. В ходе реакции фермент специфически фосфорилиру-

---

83 
ет 5
′-концевые гидроксильные группы ДНК и РНК (3′-группы не фос-
форилируются). Этот фермент часто используется в ГИ для мечения 
5
′-конца нуклеотидной цепи с помощью радиоактивного 
32
Р. Последо-
вательное действие фосфатазы и полинуклеотидкиназы приводит к 
замещению немеченого 5
′-концевого фосфомоноэфира на радиоак-
тивный без других изменений в цепи. 
Лигазы. При получении гибридных молекул ДНК требуется объ-
единение in vitro сегментов ДНК из различных источников. Лигазы как 
раз и осуществляют ковалентное сшивание фрагментов ДНК путем обра-
зования фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Для 
этого в большинстве случаев требуется отжиг цепей с комплементарными 
«липкими» концами. Однако лигаза, кодируемая фагом Т4, способна с 
невысокой эффективностью лигировать «тупые» концы ДНК. 
ДНК-полимеразы. Они описаны в подразд. 1.1. Из них в ГИ чаще 
всего используют Роl-I. С ее помощью, например, фрагменты с «лип-
кими» концами превращают во фрагменты с «тупыми» концами. 
Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза. Этот фермент 
полимеризует нуклеотиды, не используя никаких матриц, а в осталь-
ном он похож на ДНК-полимеразы. С его помощью можно, например, 
к молекулам ДНК, не имеющим «липких» концов, присоединить та-
кие концы. В частности, если большие молекулы ДНК продавливать 
через сито или энергично перемешивать раствор, происходят много-
численные ее разрывы с образованием «тупых» концов. Если к одно-
му набору фрагментов присоединить poly(dT), а к другому – poly(dA) 
и смешать эти фрагменты, то произойдет их соединение друг с дру-
гом. Пробелы, образующиеся из-за неравной длины хвостов, могут 
быть заполнены Роl-I, а концы сшиты лигазой. Такой подход исполь-
зовался при конструировании первой гибридной молекулы ДНК. 
Кроме этого, инструментами ГИ являются векторные ДНК, кото-
рые будут рассмотрены позже совместно с технологией создания гиб-
ридных ДНК.