Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Получение генов. Итак, первой задачей ГИ является получение ге-
нов, которые в дальнейшем будут использоваться для создания гибрид-
ных ДНК. Эту задачу можно решать двумя принципиально различными 
способами – искать в составе какой-либо ДНК или синтезировать ис-
кусственно необходимый ген (например, структура продукта которого 
известна) либо получить весь (или почти весь) набор генов какого-
нибудь организма, проанализировать его и выявить искомый ген. 
В настоящее время используется три основных способа получе-
ния нужных генов:

---

84 
– выделение из состава ДНК; 
– химико-ферментативный синтез (in vitro); 
– транскрипция изолированной из клетки матричной РНК с по-
мощью обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы, 
ревертазы). 
Выделение генов из ДНК. Большинство методик в генетической 
инженерии основано на вырезании из молекул ДНК определенных 
фрагментов и соединении их с другими фрагментами для получения 
рекомбинантных (химерных) ДНК. При этом фрагментация выделен-
ной из клеток ДНК осуществляется с помощью ферментов, которые 
способны расщеплять ДНК в строго определенных сайтах. В качестве 
таких ферментов используются эндонуклеазы рестрикции (рестрикта-
зы), общая характеристика которых дана в подразд. 1.1. В генетиче-
ской инженерии используются рестриктазы, образующие в ДНК од-
нонитевые («липкие») концы (при разрезе уступом), а также те, что 
формируют в ДНК двухнитевые («тупые») концы (при расщеплении 
посередине узнаваемого участка). Примером рестриктазы первого ти-
па (образующей «липкие» концы) является Eco RI, а рестриктазой 
второго типа является, например, Hind II. 
Образование «липких» концов при расщеплении ДНК имеет 
преимущество, которое состоит в возможности реассоциации об-
разованных фрагментов по гомополимерным «липким» концам 
(содержат комплементарные нуклеотиды). В таком случае появля-
ется возможность формирования ассоциатов из фрагментов, при-
надлежащих разным молекулам ДНК, что и лежит в основе боль-
шинства генноинженерных манипуляций по получению рекомби-
нантных ДНК (рис. 2.1). Образующиеся спонтанно ассоциаты 
могут быть превращены в целые молекулы путем сшивания с по-
мощью ДНК-лигаз. 
Следует отметить, что в обычных условиях «липкие» концы в со-
ставе одной молекулы могут удерживаться друг относительно друга с 
помощью водородных связей между комплементарными основания-
ми. Однако комплементарные цепочки легко разделить при неболь-
шом нагревании растворов ДНК (денатурация ДНК). При охлаждении 
«липкие» концы гибридизуются вновь за счет восстановления водо-
родных связей при соблюдении принципа комплементарности (от-
жиг). В
результате отжига набора фрагментов, полученных при воз-
действии на разные молекулы ДНК одной и той же рестриктазой, мо-
гут образоваться как исходные молекулы ДНК, так и их гибриды – 
рекомбинантные ДНК.

---

85 
Рис. 2.1. Схема образования рекомбинантных ДНК
при расщеплении разных молекул ДНК рестриктазами,
обнажающими во фрагментах «липкие» концы 
В 1972 г. в Стэнфорде Дж. Мерц и Р. Дэвис осуществили первый 
подобный эксперимент. Позднее оказалось, что не все геномы могут 
содержать сайты рестрикции для используемых рестриктаз. Особенно 
это касается небольших молекул – плазмид и профагов, которые на-
столько малы, что содержат лишь по несколько сайтов рестрикции 
для небольшого числа рестриктаз. Данное обстоятельство существен-
но ограничивает возможности метода, поэтому была разработана ме-
тодология введения в геном фрагментов ДНК, содержащих необходи-
мые сайты рестрикции. 
Для этого используют искусственно синтезированные олигонук-
леотидные ДНК с «тупыми» концами (линкеры). Линкеры синтезиру-
ют таким образом, чтобы в их составе содержались известные сайты 
рестрикции (предварительно требуется установить последовательность 
нуклеотидов в этих сайтах). ДНК для введения линкеров в ее состав рас-
щепляют одной из рестриктаз, образующих «тупые» концы, а затем 
Обработка рестриктазой Eco RI 
приводит к образованию «липких»
концов в составе разных ДНК 
Смешивание фрагментов,
обработка лигазами
Варианты рекомбинантных ДНК

---

86 
сшивают полученные фрагменты с линкерами с помощью лигаз 
(рис. 2.2). Альтернативным методом получения «тупых» концов явля-
ется механический разрыв крупных молекул ДНК при быстром пере-
мешивании раствора или продавливании его через узкое отверстие. 
В результате этих манипуляций фрагменты ДНК приобретают сайты 
рестрикции внутри добавочных последовательностей (линкеров). 
Рис. 2.2. Присоединение линкеров, содержащих сайты рестрикции
(в данном случае для рестриктазы Eco RI обозначены стрелками),
к фрагментам ДНК с «тупыми» концами 
Теперь полученный фрагмент ДНК, содержащий требуемые сайты 
рестрикции, можно присоединить к другой молекуле ДНК (например, к 
вектору), обработанной такой же рестриктазой, либо превратить в 
кольцевую форму путем сшивания взаимно комплементарных концов. 
Описанные методы выделения генов в составе фрагментов ДНК 
с помощью рестрикционных ферментов широко распространены, но 
имеют ряд недостатков. Во-первых, не всегда удается подобрать ре-
стриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, в 
котором содержится интересующий экспериментатора ген. Во-вто-
рых, в составе вырезанного фрагмента ДНК могут оказаться затруд-
няющие дальнейшее использование гена последовательности, на-
Обработка ДНК рестриктазой
Hind II приводит к образованию 
фрагментов с «тупыми» концами 
Добавление линкеров, сшивание 
фрагментов лигазами 
Фрагмент ДНК, заключенный
между линкерами 
Линкер 
Линкер 

---

87 
пример интроны в эукариотических генах. В данном случае реком-
бинантные ДНК не смогут экспрессироваться в прокариотических 
клетках, поскольку последние не обладают способностью к сплай-
сингу (подразд. 1.3).