O’zbekiston Respublikasi Oliy ta’lim, Fan va innovattsiyalar Vazirligi Mirzo Ulug’bek nomidagi

O’zbekiston Respublikasi Oliy ta’lim, Fan va innovattsiyalar Vazirligi Mirzo Ulug’bek nomidagi O’zbekiston Milliy Unversiteti Biologiya fakulteti Biologiya yo’nalishi Sirtqi bo’lim 2-kurs

103-guruh

Biokimyo va molekulyar
biologiya fanidan
MUSTAQIL ISH
Mavzu: Mikroorganizmlardan oqsil ajratib olish

Tayyorladi: __________________________
Qabul qildi: __________________________

Reja:
1.

2.
3.

Bakteriyalardan oqsillarni hujayralarni buzmasdan ajratib olish an'anaviy tozalash jarayonlari va labil oqsillarni izolyatsiyalashning asosiy soddalashuvidir. Odatda, rekombinant oqsillarni bakteriyalardan izolyatsiya qilish, hujayra qoldiqlarini olib tashlash uchun hujayra hosilini, hujayra buzilishini va homogenatni aniqlashtirishni o'z ichiga olgan operatsiyalar kaskadini o'z ichiga oladi, so'ngra yuqori darajada toza protein olish uchun xromatografik usullarning kombinatsiyasi (Demain va Vaishnav, 2009 ) . Hozirgi vaqtda hujayra buzilishining turli usullari mavjud, jumladan fermentativ hazm qilish, kimyoviy muolajalar va ultratovush. Preparativ shkalada oqsillarni ekstraktsiya qilish uchun yuqori bosimli homogenlash va frezalash usullari afzal qilingan usullardir ( Middelberg, 1995 ). Bundan tashqari, osmotik va termal zarba boshqa buzilish usullarining ish faoliyatini yaxshilash uchun qo'shimcha kuch sifatida qo'llanilishi mumkin ( Harrison, 1991 ). Barcha holatlarda va o'lchovdan qat'i nazar, olingan hujayra gomogenatini keyingi qayta ishlashdan oldin hosil bo'lgan hujayra qoldiqlarini olib tashlash kerak ( Balasundaram va boshq., 2009 ). Membran filtrlash yoki xromatografik usullar, odatda quyida ishlov berish jarayonida parchalanish bosqichini kuzatib boradi, texnologik eritmada kichik zarrachalar mavjud bo'lganda, blokirovka va ifloslanishga moyil. Shunday qilib, hujayra qoldiqlarini yoki boshqa qattiq komponentlarni samarali olib tashlash qiyin. Santrifüjlash, chuqur filtrlash yoki ularning kombinatsiyasi odatda qo'llaniladi, lekin yana kichik zarrachalarni olishda qiyinchiliklar paydo bo'ladi. Hujayra qoldiqlarini yanada parchalash uchun parchalanish davrlari sonini ko'paytirish orqali yuqori mahsulot hosiliga erishish mumkin, ammo oxir-oqibat bu yopishqoqlikning oshishiga olib keladi. Binobarin, juda yuqori markazdan qochma kuchlar yoki katta filtr birliklari talab qilinadi, ammo samarali tushuntirish natijasida past o'tkazuvchanlik hosil bo'ladi. Laboratoriya miqyosida ishlaganda, bu muammolarni yuqori samarali uskunalar yordamida hal qilish mumkin; ammo tayyorgarlik yoki undan ham ko'proq sanoat tarozida, bu qayta ishlash bosqichi og'ir shisha bo'yinni ifodalaydi. Shunday qilib, olingan komponentlar uchun yuqori selektivlik bilan muqobil texnikalar talab qilinadi.

Odatda bakterial hujayra konverti plazma membranasi va peptidoglikan hujayra devoridan iborat. Gram-manfiy shtammlar, masalan, E. coli , yupqa peptidoglikan qatlami va lipopolisakkaridlar majmuasidan tashkil topgan tashqi membranani o'z ichiga oladi, shuningdek, endotoksin deb ataladi. Pastki ishlov berish jarayonida kritik, toksik bo'lmagan chegaradan pastroq bo'lgan endotoksinni olib tashlash har qanday biofarmatsevtika mahsuloti uchun juda muhimdir. Umuman olganda, hujayra tizimining yaxlitligi va funksionalligi uning membranalarining selektiv molekulyar saralash xususiyatlari bilan ta'minlanadi. Hujayra shaklini ta'minlovchi bakterial peptidoglikan qatlami, odatda, bo'shashgan tarmoq tufayli, nisbatan katta molekulalarning tarqalishiga imkon beradi ( Demchick va Koch, 1996 , Vázquez-Laslop va boshqalar, 2001 ); aksincha, hujayra membranalari odatda oqsillar kabi makromolekulalarni passiv tashish uchun o'tkazmaydi. Hujayra membranalarining o'tkazuvchanligini oshirish uchun kimyoviy yoki fizik usullar, masalan, organik erituvchi va osmotik zarba bilan davolash, hujayrani buzish usullariga nisbatan hujayra ichidagi oqsillarni chiqarish uchun ko'proq tanlanganligi ko'rsatilgan ( Harrison, 2011 ).
Membranalar amfifil molekulalardan iborat bo'lib, ular gidrofobik, introversiv domenlar va suvli sirtlarga ta'sir qiladigan gidrofil zanjirlarni hosil qiladi. Ushbu ikki qatlamli qatlamlarning strukturaviy qattiqligi, birinchi navbatda, hidrofobik hududlardan chiqarib tashlangan suvning oraliq kuchlanishi tufayli cheklangan ( Hancock va boshq., 1994 , Nikaido, 2003 ). Bunday struktura yopiq hajmga qarab ichki va tashqi bosimlarga sezgir. Bundan tashqari, membrana qismlari orasidagi zaif o'zaro ta'sirlar lateral harakatga va ko'ndalang o'zgarishlarga imkon beradi, bu esa ikki qatlamni sirt tarangligini kamaytiradigan moddalar ta'sirida parchalanishga zaif qiladi. Shu bilan birga, atrof-muhitga keng ta'sir ko'rsatadigan bir hujayrali namunalarning membranalarida Ca ²⁺ va Mg ²⁺ kabi ikki valentli kationlar mavjud bo'lib , ular asosan manfiy zaryadlangan gidrofil qoldiqlar orasidagi itarilish kuchlarini minimallashtirish orqali strukturaning qattiqligini oshiradi ( van Loosdrecht va boshqalar, 1190 ). . Mikrobial yuzalardagi salbiy zaryadlar, shuningdek, bu hujayralarning anion almashinuvi qatronida ijobiy zaryadlar bilan elektrostatik o'zaro ta'siriga yordam beradi ( Terada va boshq., 2006 ). Suvli muhitdagi zaryadlar orasidagi tortishish yoki itaruvchi kuch intensivligi pH va ion kuchi kabi bufer sharoitlariga va oraliq masofaga bog'liq. Ilgari, ba'zi elektrostatik shovqinlar membrananing yaxlitligini buzishi va hujayra inaktivatsiyasiga olib kelishi mumkinligi ko'rsatilgan ( Gottenbos va boshq., 2001 , Leroueil va boshq., 2008 , Palermo va boshq., 2011 ). Mumkin bo'lgan tebranish mexanizmi sifatida membrana yaxlitligi uchun hal qiluvchi ahamiyatga ega bo'lgan ikki valentli kationlar yuqori zichlikdagi musbat zaryadlar bilan almashtirilishi yoki xelatlash guruhlari bilan murakkablashishi sababli neytrallanishi mumkinligi taklif qilingan (Poortinga va boshq., 2002 ) .
Proteinni olish usulimiz besh bosqichdan iborat. Birinchidan, biz kuchli asosiy anion almashinadigan qatronni maydalash orqali o'rtacha diametri bir mikron bo'lgan katyonik mikropartikullarni tayyorladik; ikkinchidan, mikropartikullar bilan bakterial hujayra suspenziyasini bir hil aralashtirdik; uchinchidan, biz aralashmani qo'shimcha aralashtirmasdan inkubatsiya qildik; to'rtinchidan, biz floklarni elyusiya buferida qayta to'xtatdik; va beshinchidan, biz suyuqlikni qattiq fraktsiyadan ajratdik.