O’zbekiston Respublikasi Oliy ta’lim, Fan va innovattsiyalar Vazirligi Mirzo Ulug’bek nomidagi

2.11 . SOD protein standartini tayyorlash
SOD protein standarti E. coli hujayralaridan Marathon A2 mikropartikullari bilan ekstraktsiya yo'li bilan tayyorlangan . Hujayralar pH 8,0 da 50 mM TRIS buferida 0,7 v/v (qatron: hujayralar) nisbatida 2 soat davomida inkubatsiya qilindi . Protein 0,2 M NaCl bilan desorbsiyalangan va keyinchalik gel filtrlash orqali tozalangan (GE dan SuperdexG75 tayyorlash darajasi). Tozalangan oqsil 8 M karbamidda 10 daqiqa davomida 100 ° C da denatüratsiya qilindi va kontsentratsiya 280 nm da absorbansdan aniqlandi . Yo'q bo'lib ketish koeffitsienti SOD aminokislotalar ketma-ketligi asosida Expasy ProtParam Tool (Shveytsariya Bioinformatika instituti, Lozanna, Shveytsariya) yordamida hisoblab chiqilgan. DGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ). Namunalarning kontsentratsiyasi SDS-PAGE va densitometriya orqali 5 nuqtali chiziqli bo'lmagan standart kalibrlash egri chizig'ini yaratish uchun baholandi.
2.12 . Tashqi membrana oqsili havolasi
E. coli homogenatining og'irroq qattiq qismi 15 daqiqa davomida 4000 × g da santrifüjlash orqali ajratildi . Supernatant toza naychalarga o'tkazildi va yorug'lik fraktsiyasi 4000 × g da 60 daqiqa santrifüjdan so'ng yig'ildi . Pelet deionizatsiyalangan suvda to'xtatildi va yuqorida aytib o'tilganidek, ketma-ket ikki marta yuvildi. Hujayra qoldiqlari va xom gomogenatning mos yozuvlari namunalari pH 8,0 da 10 M karbamid bilan 1: 5 nisbatda suyultirildi va aylanadigan shakerda 1 soat davomida inkubatsiya qilindi.
2.13 . DNK va endotoksinni aniqlash
DNK miqdori Quant-iT™ PicoGreen ^® dsDNA tahlil to'plami (Invitrogen) bilan aniqlandi. Endotoksin miqdori PyroGene™ Rekombinant Factor C tahlili bilan aniqlandi (Lonza, Bazel, Shveytsariya). SOD faolligi 19160 SOD aniqlash to'plami (Sigma Aldrich) bilan baholandi. Barcha supernatant namunalari 23 °C da 30 daqiqa davomida 16000 × g (1 ml) da santrifüj qilindi , PVDF membranalari orqali filtrlandi (0,2 mikron gözenek hajmi) va 1:10 da tegishli tampon bilan samarali o'lchov oralig'ida suyultirildi. O'lchovlar GENios Pro yoki Infinite 200 M plastinka o'quvchi (Tecan) da tegishli to'plam ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi .