O‘zbеkistоn rеspublikаsi

Выделение чистой культуры. Чистую культуру можно выделить, исполь­зуя твердую агаризованную среду 9 К Однако, лучше исполь­зовать готовые пластинки, пропитанные средой Летена (№1) или средой 9К (№2) или плотные среды, приготовленные на полиакриламидном геле. На плотных средах появляются мелкие колонии рыжевато-коричневого цвета.
Из колоний, выросших на твердой среде, проводят отсев в небольшие объемы (4—6 мл) жидкой питательной среды с Fе²⁺ (№ 2) или в колбоч­ки с сульфидными минералами. Затем проверяют чистоту культуры.
Для выделения чистой культуры Т. Ferrooxidans можно использовать метод разведений. Из накопительной культуры, в которой по данным ана­лизов имеется, например, 10⁷-10⁸ клеток (кл/мл) Т. Ferrooxidans берут 1мл раст­вора и разбавляют в 10, 100, ...1 млн. и 10 млн. раз. Можно ожидать, что в последние разведения попадут единичные клетки бактерий. Из последних разведений делают предпочтительно посевы на среду 9 К с соответствующими источниками энергии (Fе²⁺, сульфидные минералы)
Чистая культура Т. Ferrooxidans может быть получена на среде Летена (№1), содержащей 400 мг/л Fе²⁺ или на среде 9К (№ 2), содержащей 9 г/л Fе²⁺ при добавлении от I до 5 г/л Сu²⁺ (СuS0₄ .5Н₂0). Гетеротроф­ные спутники в присутствии ионов меди погибают.
Проверка чистоты. Как уже отмечалось выше, спутниками Т. Ferrooxidans могут быть факультативные автотрофы Т.Acidophilus (T.organoparus), хемолитоавтотрофы Т.Thiooxidans, гетеротрофы А.cryptum и другие. Для оценки чистоты культуры Т. Ferrooxidans проводится посев на среды для вышеука­занных бактерий, а также на МПА, МПБ, среду Эшби (№ 27), картофельный агар, крахмало-аммиачный агар, сусло-агар, а также на среду с глюкозой и Fе²⁺.
Поддержание и хранение культуры. Культура Т.Ferrooxidans поддерживается на жидкой среде 9К (№ 2) c Fе²⁺ или на той же среде с сульфидными минералами в холодильнике при 4⁰С. Пересев проводится не реже 1 раза в месяц. Известны методы длительного хранения Т.Ferrooxidans.. Ряд из них приводится ниже.
1) Смешивание с инертным или слабодеградирующим субстратом:
а) Культуру бактерий выращивают в колбах Эрленмейера на 250 мл на жидкой среде 9К в течение 48 часов на качалке, затем помещают в стериль­ные пробирки или ампулы со смесью песка и пирита, взятых в соотношении 1:3, и герметично закрывают. Можно использовать и другие соотношения песка и пирита. Песок и пирит предварительно промывают и высушивают. Ампулы запаивают, а пробирки закрывают резиновыми пробками и парафинируют. Смесь песка и пирита вносят в количестве 2-3 г на 1-2 мл культуры плотностью 10⁹ кл/мл, при рН 2-2,5 и Еh 350 -370 мВ. Fе²⁺ вносят в концентрации 4,5—4,7 г/л. В таком виде культуру хранят при комнатной температуре 2,5 - 3 года.
б) Готовят суспензию клеток Т.Ferrooxidans с определенным числом клеток, ампулы с 1 г халькопирита стерилизуют автоклавированием при 121 °С в течение 20 мин на протяжении трех дней, стерилизуют шприц и иглы к шприцу.

Затем определенное количество этой культуры (суспензия клеток) вносят с помощью стерильного шприца в стерильные ампулы с инертным носителем-лигнитом или халькопиритом (медленно окисляющийся субстрат). Ампулы запаивают и хранят при комнатной температуре, периоди­чески определяя число жизнеспособных клеток.

Хранящаяся таким образом культура остается активной в течение года.
Гута и Агате смешивали суспензию клеток Т.Ferrooxidans, содержащую 10¹² кл/мл с 1 г лигнита или 1 г халькопирит - содержащей руды. После 8 месяцев хранения окислительная активность бактерий снижалась на халькопиритной руде на 5%, на лигните - на 30%.
2) Лиофилизация.
Метод длительного хранения Т.Ferrooxidans предложен Манхе. Суть его состоит в быстром замораживании клеток. Т.Ferrooxidans выращивают при 30 °С на среде с Fe²⁺ при рН 1.6. При этом значении рН среды осаждение соединений Fe³⁺ не происходит. Затем из пипетки по каплям 48- 72-часовую культуру вносят в стеклянный сосуд, содержащий жидкий азот. Сосуд помещают в сетку из медной проволоки и погружают в блок с полистироловой пеной. Затем замороженные капли с культурой перено­сят в охлажденный сосуд объемом 2 мл, который закрывают и погружают в вакуумированный сосуд с жидким азотом при температуре от -120 до -180°С.
Показано, что при таком способе хранения Т.Ferrooxidans не теряет железоокисляющей активности даже через 36 мес., в то время как при хранпении при +4°С бактерии полностью теряли активность после 12 мес. хранения.
Высушивание клеток в вакууме проводят на среде следующего состава: порошок снятого молока 100 г; глутамат натрия 10 г; H ₂0 дист. - I л. Среды готовят с незначительным количеством дистил­лированной воды и перемешивают так, чтобы не было комков. Затем до­бавляют остаток воды и перемешивают с помощью миксера. Стерилиза­цию проводят в автоклаве 15 мин при 121°С и 1 атм.
3) Хранение в жидком азоте
1 мл суспензии клеток, содержащей 1,8-2,0 х 10¹² клеток, смешивают с 1 мл стерильного глицерина (10%). Капилляры с внутренним диаметром 1 мм и длиной 2,5 см погружают в суспензию клеток с глицерином, затем запаивают с обеих концов и помешают в жидкий азот. После 8 месяцев хранения активность бактерий снижалась не более чем на 15%.