O‘zbеkistоn rеspublikаsi

Подсчет в микроскопе
Прямой подсчет клеток бактерий проводят на предметных стеклах или в различного типа камерах, например, а камере Тома, Петрова, Хаузера и т.д. Эти методы хорошо известны микробиологам, но мало применяются для учета хемолитоавтотрофных бактерий. Ниже приводится ряд новых методик для Т. Ferrooxidans. Особенностью этих методов является то, что они позволяют не только определить количество бактерий, но и дифференцировать представителей различных видов тиобацилл. Это очень важно, поскольку на одних тех же средах часто растут бактерии разных таксонов и их быстрая идентификация затруднительна.
Метод косвенного окрашивания флуоресцентными антителами .
Этот метод позволяет в течение нескольких часов определить число клеток Т. Ferrooxidans в смешанной культуре. Для этого необходимо иметь:
А) поликарбонатный тип фильтров;
Б) продажную козью антикроличью сыворотку, меченную флюоресцирующим азотноцианатом;
В) неочищенную анти - Т. Ferrooxidans кроличью сыворотку. Для получения специфической сыворотки Т. Ferrooxidans выращивают на среде 9К (№2) в течение 7 дней при 25 °С на качалке.
Суспензию клеток получает путем центрифугирования при 40000 x q в течение 30 мин. при 4°С. Клетки дважды промывают в 0,1 н H₂SO_{4 ,} для удаления железа суспендируют в 0,01 н H₂SO₄ и хранят при 4°С.
Перед инъекцией клетки промывают 3 раза фосфатно - солевым буфером (ФСБ) (0,85% NаС1, 0,1 М Nа - К - фосфатном буфере, рН 7,4) и суспендируют в солевом растворе до концентрации 10⁹ кл/мл. Солевой раствор содержит: NаС1 8, 0 г; КСl 0.4г, МgSО₄ · 7Н₂О 0,1 г. СаСl₂ 0.1 г,. Na₂HPO₄ 0,06 г; декстрозу 0,8 г; галактозу 0,8 г и 2,3 мл 0,4% раствора фенолового красного на I л дистиллированной воды . Этот раствор стерилизуют фильтрованием и хранят при 4°С. Клетки в количестве 1,0; 1,5 или 2.10⁹ вводят молодым кроликам в ушную вену с интервалами в 4 суток, а затем через неделю берут кровь из сердца. Сыворотку готовят центрифугированием собранной крови при 1 000 х g в течение 30 мин при 4⁰ С, чтобы удалить клетки бактерии. Титр агглютинации иммуноглобулинов, полученных на культуру Т. Ferrooxidans согласно методу Байлера и Скотта был более, чем 1: 2 500. Он поддерживается в кроликах путем периодического подкожного введения 2x10° клеток.
Иммуноглобулины, не специфичные к Т. Ferrooxidans, удаляют из сыворотки адсорбцией на смеси клеток Staplococcus aureuse , Pseudomonas aeruginosа. Escherichina coli и на неизвестных видах Thiobacillus , выделенных
из этих же рудничных вод. Сыворотку смешивают с этими клетками и оставляют на ночь при 4 °С. Затем смесь центрифугируют при 20 000х g в течение 15 мин при 4 ° С. Очищенную сыворотку разбавляют в 10 раз 0,1 М Nа-К - фосфатным буфером, стерилизуют фильтрованием, разливают по 0,5 мл и хранят при -10°С. Сыворотку до и после адсорбции проверяют на специфичность к Т. Ferrooxidans путем окрашивания различных бактерий, описанных выше, на предметном стекле, используя метод флуоресцентных антител.
Метод количественного определения Т. Ferrooxidans заключается в следующем. Образцы по 50 мл кислой рудничной воды фильтруют через поликарбонатные фильтры (Nucleopor D = 25 мм, размер пор 0,4 мкм), которые предварительно вымачивают в индийских чернилах несколько минут. Затем фильтры стерилизуют 25 мл ФСБ. Для ингибирования неспецифической флюоресценции на фильтры добавляют 0,2 мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) (20 мг/мл в 0,01 М Na-K - фосфатного буфера при рН 7,4). После 30 мин непрореагировавший бычий сывороточный альбумин удаляют отсасыванием, и фильтры покрывают 0,2 мл кроличьей сыворотки, полученной на культуре Т. Ferrooxidans. Спустя 30 мин непрореагировавшую сыворотку удаляют промыванием, по крайней мере, 50 мл ФСБ. После этого 0,2 мл флюоресцирующего изотиоционата (FIТС), связанного с козьей антикроличьей сывороткой (Саррег , Labor ; концентрация антител-2,8 мг/л), наносят на фильтры и оставляют для протекания реакции на 30 мин избыток FIТС - связанную сыворотку.
Окрашенные фильтры помещают на предметные стекла к нескольким каплям ФСБ-глицериновой смеси (1:9 об/об) и покрывают покровным стеклом.
Фильтры на предметном стекле просматривают в люминесцентном микроскопе. Число флюоресцирующих клеток на площади фильтра 0,01 мм² определяют при подсчете 50 таких площадей для каждого образца с помощью окулярной сетки. Число клеток в I мл образца рассчитывают как значение числа клеток на площади 0,01 мм², умноженное на 10³
Известны и другие новые методы учета и дифференциации Т. Ferrooxidans например, метод иммунологической и электрофорэтической идентификации различных штаммов Т. Ferrooxidans в культуре, содержащей другие железоокисляющие или гетеротрофные бактерии.
Джейтс и Холмс предложили для этих целей метод использования молекулярных проб, состоящих из клонированных последовательностей ДНК. При наличии соответствующей базы эти методы могут быть использованы в лабораторной практике.
При чановом выщелачивании металлов приходится иметь дело с большой биомассой бактерий, причем оценивать ее необходимо в пульпе, т.е. в жидкой и твердой фазах, в короткие периоды времени. Ниже предлагается ряд методов, разработанных для учета биомассы Т.Ferrooxidans в технологических процессах.