Universum: химия и биология
Download 1.91 Mb. Pdf ko'rish
|
5(107 1)
|
часть трипсинового соевого бульона с 1,5% агара) с добавлением снятого молока до конечной концен- трации 5%. Кольцо, появляющееся вокруг колоний на первый-второй день выращивания указывало на присутствие внеклеточной протеазы [2]. Глюканазную активность (глюканаза) обнаружи- вали при использовании лишайникового глуканового субстрата в чашках Петри, и образование чистых зон при росте бактерий, указывало на разрушение суб- страта [18]. Идентификация бактерий, стимулирующих рост растений, методом MALDI-TOF MS - анализа. Для идентификации выделенных штаммов использовали масс-спектрометрию с лазерной де- сорбцией/ионизацией с использованием цельнокле- точного матрикса (MALDI)–(TOF). Подготовку образцов проводили в соответствии с протоколом экстракции этанолом/муравьиной кислотой, реко- мендованным Bruker Daltonics (Бремен, Германия). Изоляты выращивали на трипсиново-соевом агаре (TSA, Difco Laboratories, Детройт, Мичиган, США) в течение 24 ч, и примерно 10 мг клеточной массы смешивали с 300 мкл воды, а затем встряхивали для образования гомогенной суспензии. К суспензии до- бавляли 900 мкл этанола и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в 50 мкл 70%-ной муравьиной кислоты и осторожно смешивали с 50 мкл ацето- нитрила. После центрифугирования 1 мкл жидкой части супернатанта сразу же наносили на пятна MALDI-TOF MS. Каждую сушили и покрывали 1 мл матрицы (α-циано-4-гидроксикоричная кислота в 50% водном ацетонитриле, содержащем 2,5% три- фторуксусной кислоты). Масс-спектры получали с использованием спектрометра MALDI-TOF MS в линейном положительном режиме (MicroflexTMLT, Bruker Daltonics, Бермен, Германия) в диапазоне масс 2–20 кДа. Стандарт бактериального теста (BTS, Bruker Daltonics, Бремен, Германия) использовали для ка- либровки прибора. Спектры импортировали в про- граммное обеспечение MALDI BiotyperTM (Bruker Daltonics, Германия), а затем обрабатывали и анали- зировали с использованием стандартного сравнения с соответствующими спектрами данных в выходной базе данных MALDI BiotyperTM (версия 3.0, Bruker Daltonics, Германия). |
