Ўзбекистон республикаси соғЛИҚни сақлаш вазирлиги фармацевтика таълим ва тадқИҚот институти малака ошириш ва қайта тайёрлаш маркази

ЎЗБЕКИСТОН РЕСПУБЛИКАСИ СОҒЛИҚНИ САҚЛАШ ВАЗИРЛИГИ
ФАРМАЦЕВТИКА ТАЪЛИМ ВА ТАДҚИҚОТ ИНСТИТУТИ

МАЛАКА ОШИРИШ ВА ҚАЙТА ТАЙЁРЛАШ МАРКАЗИ

Фан: инструментал тахлил усуллари


Мустақил иш 9
Мавзу: Гел хроматографияси, назарий асослари ва дори воситалари таҳлилида қўлланилиши


Бажарди: Абдурахмонов М


Қабул қилди: проф. В.Н. Абдуллабекова


Тошкент 2023
Гель-хроматографик таҳлил.

Тақсимловчи хроматографиянинг турларидан фарқли ўлароқ гель-хроматографиясида қўзғалувчи ва қўзғалмас фаза сифатида бир хил эритувчи қўлланилади. Бунда қаттиқ-фаза яъни гель заррачалари устидан оқим бўйича харакатланувчи эритувчи қисми қўзғалувчи фаза вазифасини бажаради ва аниқланувчи аралашма компонентларини колонка бўйлаб харакатлантиради. Қўлланилаётган эритувчининг иккинчи қисми эса гел заррачалари ички ғавакларига шимилади ва шу холда қўзғалмас фаза вазифасини бажаради.

Молекулалар ўлчами турлича бўлган аралашмаларда моддаларни бир-биридан ажралиш содир бўлади, гел заррачаларида ғовакларнинг ўлчами бир хил бўлиб, у ўзидан кичик хажмли молекулаларни, ғоваклар ичига ўтказади. Текширилувчи аралашма гел орқали фильтрланганда кичик хажмли молекулалар гел ғовакларига шимилиб ғовакдаги эритувчида ушланиб қолади, катта йирик молекулалар эса гел заррачалари орасидан гел ғовакларига шимилмасдан қўзғалувчи эритувчи билан бирга харакатланади. Демак аввал йирик хажмли молекулалар ювилади, кичик хажмли молекулалар эса йирик молекулалардан сўнг ювилади. Шундай қилиб гел хроматографияси модда аралашмасини модда молекуласи хажмига ва массасига боғлиқ холда бир-биридан ажратади. Бу усул содда, тез ва энг кераклиги моддалар аралашмаси бошқа хроматографик турларига нисбатан анча енгил шароитда ажратилади.
Модда аралашмасини ажратишда асосий факторлардан ташқари, қўшимча, яъни адсорбция ва кимёвий факторлар хам таъсир этади. Хроматографиялаш шароитини танлангада булар хисобга олиниши лозим.
Гелларни биринчи бўлиб 1959 йилда Порат ва Флодинлар суюқ аралашмалар учун қўллаганлар.
Гел қатламини тоза эритувчи билан ювилганда катта хажмли молекулалар эритувчи суюқлик харакат тезлигига яқин тезликда харакатланади, бир вақтда кичик хажмли молекулалар эса гел ғовакларига шимилган бўлганлиги туфайли секин кечроқ харакат ланади. Шундай қилиб моддалар аралашмаси гел қатламидан молекула хажмига боғлиқ холда бирин-кетин ажрала бошлайди.
Гел хроматография усулини қўллаш аниқланувчи моддалар аралашмаси компонентлари бир хил молекуляр массага эга бўлган холлар учун қулай хисобланади. Бунда аниқланувчи модда билан гел фазани орасидаги ўзаро таъсир фарқи асосида моддалар ажралади. Одатда икки хилдаги ўзаро таъсир намаён бўлади:
1) зарядланган ажралувчи молекуласи зарядланган зарралар ўртасидаги таъсир кучи;
2) гел қобиғидан дисперс кучи холида бўктирилган гел фазасида эриган моддалар билан боғлиқ ионоген гурухлар таъсири.
Гел хроматографияси икки турда, яъни колонкали ва юпқа қаватли усулларда қўлланилади.
Гел хроматографиясининг назарий асослари.

Найчага тўлдирилган гел ва эритувчи орасида тўғри муносабатини аниқ бўлиши учун гел қатламининг нисбий хажмини билиш мақсадга мувофиқ. Гел устунинг умумий хажми (Vt) унинг уч хил хажмий ўлчамлар йиғиндисидан иборат:

сиртқи хажм (Vc ), яъни гел заррачалари оралиқ хажми; гел ғоваклари ички хажми (Vq); қуруқ гел заррачаларининг ўз хажми (матрица хажми) Vм.

Vt=Vс+Vq +Vм

Одатда умумий хажм идиш хажмига тенг бўлади.

Сиртқи хажм. (Vс). Гел билан тўлдирилган хроматографик найчага қўйилган суюқликни гел қатламлари орасига шимилган хажми билан белгиланади. Гел ғовакларининг ички хажми Vq гел заррачаларининг ғоваксимонлиги билан боғлиқ. Ксерогеллар яъни кам шимувчи ярим қаттиқ гелларда ғовак хажмини аниқлаш (Vq)осон. Бунинг учун гелнинг эрувчанлик хажми Sr аниқланади . У 1 г қуруқ гел шимган суюқлик хажми билан белгиланади.
Гел эрувчанлик хажмини аниқлаш учун тортиб олинган, аниқ миқдордаги гел устинига қўлланилиши зарур бўлган эритувчидан қуйиб гелга шимдирилади. Ортиқча эритувчи центрифугалаб ажратиб олинади ва эритувчи билан тўйинган гел қайта тортилади. Массалар фарқи гелнинг шимган хажмини белгилаб беради. Бу гел ички хажмидир:
Vq= g .Sr/ Р
(Vq) – гел ғоваклар ички хажми
g - қуруқ гел массаси
р - эритувчи зичлиги
Sr - гелнинг ғовакдаги хажми
Қуруқ гелдаги заррачаларнинг хажмини (Vм) аниқлаш учун аввал гел учун фойдаланилган полимернинг нисбий хажмини билиш керак. Бу қийматни хар доим аниқлаш мумкин эмас. Шунинг учун Vм қийматни гелни бўккан зичлик қийматидан фойдаланиб қуйидаги тенглама асосида хисобланади.
Sr.Pr(Vt-Vч)
Vм= ------------------
P.(Sr/Pr+1)
Бунда: Vr - ташқи хажм
Vt - умумий хажм
Vq - калонкадан чиқиш хажми
Расмда гел хроматографиясида иккита модданинг хроматограммаси тасвирланган.
Vе – ташқи хажм (сиртқи)
Vq - ички хажм
Vt - умумий хажм
Vчиқ -чиқиш хажми
VS – бўлиниш хажми

Крахмал (К) ва глюкозани (Г) сефадексдаги гел хроматограммаси.

Гел хроматографияда Vr-ажратиш хажми ўлчами хам мавжуд бўлиб, бу хажм, гел устунига текширилувчи аралашма юборилганда токи ажралиб чиқаётган ажралмада модда максимал концентрацияга етгунча ўтган эритувчи хажми билан белгиланади.
Ажратиш хажми ажратилаётган аралашма молекуласи ўлчамига боғлиқ. Тажрибаларда тасдиқланишича ажратиш хажмига ювилаётган модда концентрацияси хам ювилиш тезлиги хам калонка харорати хам таъсир қилмайди. Ажралиш хажми ажралаётган модданинг молекуляр массаси, логарифмига тўғри пропорционал.
Гел хроматографиясида жараённи эффективлиги моддаларни зоналарда ювилиши ва бу билан боғлиқ холда теоритик тарелкалар эффективлиги ортади. Гел хроматографиясининг сезиларли биринчи фактори, бу усулда хроматографик жараёнда кам хажмдаги гел иштирок этади ва моддаларнинг гел қатлами бўйлаб харакатланишига модда ва гел орасидаги ўзаро таъсир деярли сезилмайди. Натижада гел хроматографиясининг калонка эффиктивлиги ортади.
Иккинчи фактор, ювилиш жараёнида диффузион тенглик жуда секин ўрнатилади. Бу таъсирларни камайтириш учун майда заррачали геллар ва ювилиш тезлигини камайтириш талаб қилинади. Молекуляр масса камайиши билан диффузия тезлашади, кичик молекулали моддалар ва секин ювилишда диффузион таъсир сезилмайди. Ювилишга таъсир этувчи энг асосий омил диффузион тенгликка аста-секин эришишдан иборат.
Гел хроматографияси бошқа хроматографик усуллардан моддаларни ажралиш механизм билан фарқланади. Қўзғалмас фазадаги модда концентрациясининг қўзғолувчи фазадаги концентрациядан кам бўлиши метод учун характерлидир. Қўзғалмас ва қўзғалувчи фаза фарқ қилмаган холда қўзғалмас фаза гел структурасига боғлиқ холда гел ғовакларига шимилади.
Агарда турли ўлчамдаги молекуляр массали турли дори моддаларни гел хроматографиясида бир-биридан ажратилганда яхши натижаларга эришилади. Бунда айрим моддалар учун ички хажм тўғри келиб, қолган таркибдаги моддаларни ажралишига ўлиқ эришилмайди. Шуни инобатга олиб Лорент Т.С., Килландер Ж., томонидан молекулаларни ажралишидаги жараённи аниқлаш учун қуйидаги формула тавсия этилади:

Vч - Vс
К = ------------

Vt - Vс

К - моддани ажратиб олишдаги энг қулай катталик.

Бунда колонкани тўлдирилган гел зичлиги ўрнига қўзғалувчи фаза сифатида фойдаланган эритувчининг хусусияти ахамиятга олинган. Бу коэффицент орқали қўзғалмас ва қўзғалувчи фазаларнинг хусусиятларини аниқлаш мумкин.
К қийматига асосланиб моддаларни ажралиб чиқиш Vs қийматини аниқлаш мумкин. Vs = Vч- Vч= (K-K). (Vt-Vc).
Штрихлар иккита моддани хроматографик ажралиши тушинилади.

Геллар ва эритувчиларни танлаш.

Геллар юмшоқ, ярим қаттиқ ва қаттиқ гелларга бўлинади. Уларнинг хар бири гидрофил ва гидрофоб, бўлишлари мумкин. Юмшоқ геллар. . Бу тур геллар юқори молекуляр органик бирикмалар бўлиб, кам сонли ёнбош боғлардан иборат. Бундай геллар кўп миқдорда эритувчини шимиб шишади ва ўзининг асосий хажмини оширади. Уларнинг ғоваклиги шимилган эритувчи хажмига тўғри пропорционал холда ( бир неча баробар хажмда) ортади. Натижада юмшоқ гел хажми ортиши хисобига, гелнинг ўзи деформацияланади. Юмшоқ геллар . кичик молекулали моддаларни кам оқим тезлигида ажратиш учун қўлланилади. Юмшоқ геллар кўпроқ юпқа қатлам хроматографиясида кенг қўлланилади. Гидрофил гелларга сефадекс ёки декстринли геллар кириб, уларда -О-СН2СН(ОН)СН2-О типдаги бирикиш боғлари водородли боғлар хусусиятига эга. (полиакриламид гели ва крахмал).

Органик эритувчилар билан ишланганда гидрофил сефродексига оксипропил гурухи киритилиб олинган липофил сефадекси ишлатилади. Юмшоқ геллар юқори эффективликка эга. Юмшоқ гелларда хроматографиялашни одатда гел-филтрлаш деб номланади.

Ярим қаттиқ геллар.

Бундай геллар полимерланиб олинади. Улар юқори ўтказувчанликни таминлайди ва ғовак ўлчамларига боғлиқ бўлмаган ўртача хажмга эга. Ярим қаттиқ геллар бўктирилганда ўз хажмини сезиларсиз ( 1,1 - 1,8 баробар) оширади, ярим қаттиқ геллар босимга чидамли ва деформацияланмайди. Улар гидрофоб геллар хисобланади. Ярим қаттиқ гелларни гидрофиллигини ошириш уларнинг кимёвий ёки физик хусусиятларини ўзгартириш эвазига бажарилади, масалан: сульфирлаш каби.

Асосан стирол ва дивинилбензолни сополимерланиши махсулотлари ярим қаттиқ геллар бўлиб, стирогеллар деб юритилади. Поливинилацетатли геллар хам ярим қаттиқ гелларга киради.

Қаттиқ геллар.

Буларга силикагел ва ғовакли шиша киради. Ғовакли шиша гел бўлмаса хам гел ўрнида ишлатилади. Қаттиқ гел ғоваклари доимий бўлади ва хар қандай шароитда хам ўз хажмини ўзгартирмайди ва юқори ўтказувчанлигини намаён қилади. Улар гидрофил ва лиофилликни намоён қилади. Силикатлар ўзларида гидроксил гурухларини сақлаши қаттиқ гелларнинг камчилиги хисобланади. Иккинчи камчилиги уларнинг юмшоқ ва ярим қаттиқ гелларга нисбатан катта ювилувчанликка эгалигидир. Қаттиқ гел сифатида одатда ғовакли силикагел (порасил), назорат қилинувчи ғовакли шиша ва бир хил ўлчамли ғовакли синтетик кремнезем (аэросиликагеллар) қўлланилади.

Эритувчиларни танлаш.

Гел хроматографияда қўлланиладиган эритувчиларга қўйиладиган талаблар,уларни текширилувчи бирикмалар аралашмасини эрита олиши, гел сиртини хўллаши ва гел сиртига шимилмаслиги билан тушунтирилади. Юмшоқ геллар учун қўлланиладиган эритувчи гелни шишириши зарур. Гел тўлдирилган идишга қўйилган эритувчи гел заррачалари билан хамда хроматографияланувчи модда билан бир хил таъсирда бўлиши керак. Бунда эриган модда гел заррачалари ичида фақат диффузияланади. Яъна эритувчининг ёпишувчанлиги хам ахамиятга олинади ва эритувчи имкон борича ёпишқоқ бўлмаслиги керак.

Гел хроматографиянинг қўлланилиши.

Гел хроматографиясида шиша найни гел билан тўлдириш катта ахамиятга эга. Гел билан тўлдириш гел тури ва ишлатилиши билан боғлиқ. Агарда юмшоқ гель қўлланилса гель аввал ажратиш учун олинган эритувчида бўктирилиши ва шиширилиши керак. Ярим қаттиқ геллардан фойдаланилганда аввал гель (суспензияси) бўтқаси тайёрланади, эритувчи билан аралашма зичлиги қуруқ гел зичлигига тенг бўлмоғи керак.

Гел хроматографияси учун ички диаметри 8-10мм га тенг найчалардан фойдаланилади. Найча диаметрини 50 мм гача катталаштириш эффективликни оширади, лекин найча диаметрини камайтириш тавсия этилмайди.

2-расм. Гел хроматография усулида моддаларни ажралиш чизмаси:

а – ажралишнинг бошланинши,
б –ажралиш жараёни,
в ажралишнинг тугаши;